免疫組庫(kù)測(cè)序常常用來(lái)分析當(dāng)下的和過去的免疫應(yīng)答反應(yīng)。最常應(yīng)用領(lǐng)域包括：自身免疫性疾病的表征、腫瘤學(xué)、傳染病中和抗體的發(fā)現(xiàn)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞以及用作研究殘留病的工具。二代測(cè)序（NGS）平臺(tái)在讀長(zhǎng)和通量方面的最新進(jìn)展促進(jìn)了免疫組庫(kù)測(cè)序的發(fā)展。

NEBNext^? 免疫測(cè)序試劑盒通過對(duì) B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞全長(zhǎng)免疫組庫(kù)分析，能獲得體細(xì)胞的所有突變信息。該試劑盒提供引物模塊，可用于分析完整的 V、D、J 區(qū)域和 IgM、IgD、IgG、IgA、IgE 亞類，并分析 BCR 輕鏈、BCR 重鏈、TCRα 鏈和 TCRβ 鏈。該試劑盒還提供唯一分子標(biāo)簽序列（UMI），將來(lái)源于同一個(gè)分子的 PCR 產(chǎn)物組成共有序列，以便提高測(cè)序準(zhǔn)確性，消除 PCR 偏差。Galaxy 平臺(tái)提供一個(gè)開源軟件工具——pRESTO，用于在本地或云端開展超強(qiáng)生物信息分析。為了確保不熟悉 Galaxy 平臺(tái)的用戶能成功使用分析軟件，pRESTO 提供教學(xué)教程。

NEBNext^? 免疫測(cè)序方法的特點(diǎn)

• 制備可變序列的全長(zhǎng)信息（包括亞類信息），使僅測(cè)序 CDR3 區(qū)域不能獲得的下游抗體合成和功能信息成為可能。

• 取消可變區(qū)域引物的使用，降低了引物池的復(fù)雜度，實(shí)現(xiàn)了同步無(wú)偏差導(dǎo)出 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞受體轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。

• 從相同轉(zhuǎn)錄本獲得的重復(fù)數(shù)據(jù)，組成共有序列，降低 PCR 偏差，提高測(cè)序準(zhǔn)確性；UMIs 能夠準(zhǔn)確定量樣本中存在的每個(gè)克隆。

• 提高免疫組庫(kù)測(cè)序的靶點(diǎn)捕獲效率，優(yōu)化在總 RNA 中，僅占微克量的免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)分析

抗體和 TCR 結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)化示意圖

免疫組建庫(kù)流程

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

• 通過對(duì)受體序列的深入分析，揭示復(fù)雜的免疫系統(tǒng)

• 對(duì) B 細(xì)胞受體（BCR）和 T 細(xì)胞受體（TCR）進(jìn)行富集和測(cè)序

• 制備 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞的全長(zhǎng)免疫基因組庫(kù)

• 使用唯一分子標(biāo)簽序列（UMI）準(zhǔn)確定量轉(zhuǎn)錄本

• 使用用于生物信息流程（教程）的開源軟件工具——pRESTO 分析數(shù)據(jù)

NEBNext^? 免疫測(cè)序試劑盒（人）部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

使用唯一分子標(biāo)簽序列（UMI）實(shí)現(xiàn)克隆型的精準(zhǔn)檢測(cè)。比較克隆型頻率：使用 10 ng 和 100 ng T 細(xì)胞總 RNA 制備人類 TCR 文庫(kù)，在有或沒有 UMI 情況下分別建庫(kù)。根據(jù)有 UMI 的測(cè)序結(jié)果，對(duì)前 100 個(gè)高表達(dá)克隆型進(jìn)行排序。重復(fù)建庫(kù)，克隆型頻率重疊繪制于圖中。每個(gè)條形或圓點(diǎn)代表一個(gè)克隆，該克隆經(jīng)過總讀長(zhǎng)分析或使用 UMI 過濾。使用 UMI 可對(duì)原始樣本中的起始 RNA 分子進(jìn)行絕對(duì)定量。當(dāng)將克隆按照富集度從高到底進(jìn)行排序，沒有 UMI 的數(shù)據(jù)會(huì)導(dǎo)致 PCR 或測(cè)序擴(kuò)增的偏差，從而誤導(dǎo)樣本中克隆型頻率的分析。UMI 的使用通過對(duì)起始樣本中 RNA 的絕對(duì)定量來(lái)校正偏差。使用 UMI 也可以在重復(fù)本之間實(shí)現(xiàn)更好的相關(guān)性，尤其是起始量較低時(shí)。各個(gè)文庫(kù)向下抽樣 500,000 reads。

使用 NEBNext 免疫測(cè)序試劑盒（人），能夠在同一管中制備人 BCR 和 TCR 文庫(kù)。分別使用 1 μg、100 ng 和 10 ng 人 PBMC 總 RNA（Takara Bio #636592）制備人 BCR+TCR 文庫(kù)，每個(gè)起始量都做有平行實(shí)驗(yàn)。所有文庫(kù)向下抽樣 950,000 reads。使用 pRESTO 工具完成 reads 過濾、序列組裝和基于 UMIs 組成共有序列。使用 MiGMAP 鑒別 V、D 和 J 區(qū)域。圖（A）表示每個(gè)人類 PBMC 總 RNA 起始樣本檢測(cè)到的克隆型數(shù)量。圖（B）表示各文庫(kù)中 B 細(xì)胞鏈和 T 細(xì)胞鏈所占百分比。

NEBNext^? 免疫測(cè)序試劑盒（小鼠）部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

使用唯一分子標(biāo)簽序列（UMI）實(shí)現(xiàn)克隆型的精準(zhǔn)檢測(cè)。在有或沒有 UMI 情況下，比較小鼠 TCR 克隆型頻率。根據(jù)有 UMI 的測(cè)序結(jié)果，對(duì)前 100 個(gè)高表達(dá)克隆型進(jìn)行排序。在有或沒有 UMI 情況下，重復(fù)建庫(kù)，克隆型頻率重疊繪制于圖中。每個(gè)條形或圓點(diǎn)代表一個(gè)克隆，該克隆經(jīng)過總讀長(zhǎng)分析或使用 UMI 過濾。使用 UMI 可對(duì)原始樣本中的起始 RNA 分子進(jìn)行絕對(duì)定量。當(dāng)將克隆按照富集度從高到底進(jìn)行排序，沒有 UMI 的數(shù)據(jù)會(huì)導(dǎo)致 PCR 或測(cè)序擴(kuò)增的偏差，從而誤導(dǎo)樣本中克隆型頻率的分析。UMI 的使用通過對(duì)起始樣本中 RNA 的絕對(duì)定量來(lái)校正偏差。使用 UMI 也可以在重復(fù)本之間實(shí)現(xiàn)更好的相關(guān)性，尤其是起始量較低時(shí)。各個(gè)文庫(kù)向下抽樣 500,000 reads。

使用 NEBNext 免疫測(cè)序試劑盒（小鼠），能夠在同一管中制備小鼠 BCR 和 TCR 文庫(kù)。分別使用 10 ng、100 ng 和 1,000 ng 小鼠脾臟總 RNA（Takara Bio #636605）制備小鼠 BCR+TCR 文庫(kù)，每個(gè)起始量都做有平行實(shí)驗(yàn)。所有文庫(kù)向下抽樣 1,000,000 reads。使用 pRESTO 工具完成 reads 過濾、序列組裝和基于 UMIs 組成共有序列。使用 MiGMAP 鑒別 V、D 和 J 區(qū)域。圖（A）表示每個(gè)小鼠脾臟總 RNA 起始樣本檢測(cè)到的克隆型數(shù)量。圖（B）表示各文庫(kù)中 B 細(xì)胞重鏈（IGH）和輕鏈（IGK 和 IGL）以及 Tα 鏈（TRA）、β 鏈（TRB）、δ 鏈（TRD）和 γ 鏈（TRG）所占百分比。

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