單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術(shù)作為一項(xiàng)革命性工具，在單細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，已經(jīng)被廣泛用于多個(gè)方面的生物醫(yī)學(xué)研究，包括腫瘤異質(zhì)性研究、新細(xì)胞類型的鑒定、組織發(fā)育與細(xì)胞分化過程研究和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究等。通過scRNA-seq獲得高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后，利用原位組織學(xué)驗(yàn)證是目前流行的研究策略，也是對(duì)單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果篩選出的有價(jià)值分子的空間分布定位回溯以及結(jié)果真實(shí)性的驗(yàn)證。

由于這其中的很多原位待檢測(cè)分子屬于新發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)，缺乏有效的免疫組化抗體；也存在一些例如GPCR,離子通道這類無法制備免疫組化抗體的靶點(diǎn)；而對(duì)于分泌型細(xì)胞因子由于其合成后被第一時(shí)間排出到細(xì)胞外，故無法通過免疫組化方式定位分泌細(xì)胞；包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA在內(nèi)的一些靶點(diǎn)則不可能使用免疫組化的原位檢測(cè)方法進(jìn)行靶點(diǎn)追蹤。對(duì)于以上的這些分子的原位檢測(cè)，目前通常使用RNAscope技術(shù)進(jìn)行解決。RNAscope技術(shù)以其具有高度敏感性和特異性、單分子可視化、多通道靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)（在一張切片上同時(shí)檢測(cè)12個(gè)靶點(diǎn)）等特有的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于原位驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果。本文將以2019年使用RNAscope技術(shù)驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果發(fā)表的一些代表性文章為例為大家介紹相關(guān)研究進(jìn)展。

2019年來自麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究學(xué)者在《Cell》雜志上發(fā)表的一篇研究論文揭示了潰瘍性結(jié)腸炎的耐藥機(jī)制[1]。在這項(xiàng)研究中，研究人員利用scRNA-seq從18例潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者和12例健康人的結(jié)腸粘膜中生成了366，650個(gè)細(xì)胞的圖譜，以此來了解細(xì)胞類型特異性和作用途徑，揭示了51個(gè)上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞亞群。在UC患者中，腫瘤壞死因子(TNF)蛋白水平較高，抗TNF藥物可減輕炎癥并治愈許多患者的組織。然而，大約30%的患者對(duì)治療沒有響應(yīng)，而那些有響應(yīng)的患者隨著時(shí)間的推移變得具有耐藥性。研究人員此前已經(jīng)確定了耐藥性相關(guān)的基因，但尚不清楚結(jié)腸中哪些特定的細(xì)胞類型表達(dá)了這些基因。在此次研究中，單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析表明BEST4 +腸上皮細(xì)胞，RSPO3+成纖維細(xì)胞，IL13RA2 + IL11 +炎性成纖維細(xì)胞等細(xì)胞亞群與抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的抗性有關(guān)。研究人員進(jìn)一步利用RNAscope原位雜交結(jié)合免疫熒光驗(yàn)證并從空間定位上展現(xiàn)了單細(xì)胞測(cè)序的主要發(fā)現(xiàn)。下圖為使用RNAscope檢測(cè)到的健康人BEST4 +腸上皮細(xì)胞（左圖，紅色表示RNAscope檢測(cè)到的BEST4的RNA信號(hào)）與RSPO3+成纖維細(xì)胞（右圖，紅色表示RNAscope檢測(cè)到的RSPO3的RNA信號(hào)）在腸道中的定位情況。

盡管大多數(shù)成纖維細(xì)胞亞群同時(shí)存在于健康個(gè)體和UC患者中，但一類稱之為炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（IAFs）的亞群在一些病人的炎癥組織中表達(dá)擴(kuò)大了189倍。IAFs富含許多與結(jié)腸炎、纖維化和癌癥相關(guān)的基因，包括IL11、IL24和IL13RA2。研究人員就利用RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)了健康組織與炎癥組織中的炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的特征基因表達(dá)，證實(shí)了表達(dá)IL13RA2的炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞在炎癥組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織（見下圖，紅色為RNAscope檢測(cè)到的IL13RA2的RNA信號(hào)）。         

除了炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞外，單細(xì)胞測(cè)序分析結(jié)果也表明在UC患者樣本中，同時(shí)表達(dá)CD8和IL-17的T細(xì)胞所占比例更高。在進(jìn)一步的RNAscope原位雜交驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)CD4+與CD4- T細(xì)胞都共表達(dá)CD8與IL17A（見下圖，紅色為RNAscope檢測(cè)到的IL17A的RNA信號(hào)）。其中CD4+ CD8+IL17A+ T細(xì)胞是一類新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞亞群，在炎癥組織中，CD4+ CD8+IL17A+ T細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。

腫瘤壞死因子（TNF）的表達(dá)在UC患者中發(fā)生改變，Treg細(xì)胞從健康組織向炎癥組織擴(kuò)展，是炎癥過程中TNF的主要來源。在炎癥組織中，TNF在Treg細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。研究人員利用RNAscope原位雜交檢測(cè)了IL10，TNFA以及Treg細(xì)胞標(biāo)志基因FOXP3的表達(dá)，驗(yàn)證了在炎癥組織中Treg細(xì)胞中TNF的表達(dá)顯著上升（見下圖，白色為RNAscope檢測(cè)到的FOXP3的RNA信號(hào)，綠色為RNAscope檢測(cè)到的IL10的RNA信號(hào)，紅色為RNAscope檢測(cè)到的TNFA的RNA信號(hào)）。

反復(fù)肝損傷導(dǎo)致進(jìn)行性纖維化，破壞肝臟結(jié)構(gòu)，再生潛能以及肝功能。肝星狀細(xì)胞（HSCs）是纖維化過程中病理基質(zhì)的主要來源。2019年英國(guó)愛丁堡大學(xué)Dobie等人在《Cell Reports》發(fā)表的一篇研究論文將健康小鼠與肝纖維化小鼠的肝間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析，揭示了肝小葉中HSCs的空間和功能分區(qū)，鑒定了兩種有獨(dú)特基因表達(dá)特征的不同HSCs細(xì)胞亞群[2]，一種稱為門靜脈相關(guān)HSCs（PaHSCs），另一種稱為中央靜脈相關(guān)HSCs（CaHSCs）。為了確定這兩種HSCs亞群的空間分布，研究人員進(jìn)一步利用RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)了PaHSCs的標(biāo)志基因NGFR與CaHSCs的標(biāo)志基因Adamtsl2的表達(dá)（見下圖，左圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的NGFR的RNA信號(hào)，右圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的Adamtsl2的RNA信號(hào)）。通過與免疫熒光技術(shù)結(jié)合，證實(shí)了肝小葉中NGFR+ HSCs與門靜脈相關(guān)肝細(xì)胞（E-cadherin+）共定位，而Adamtsl2+ HSCs與中央靜脈相關(guān)肝細(xì)胞（Cyp2e1+）共定位。

急性CCL4誘導(dǎo)的肝損傷的特征是HSCs顯著增值以及被激活為肝小葉中心區(qū)域產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究PaHSCs和CaHSCs分化為致病性膠原產(chǎn)生細(xì)胞的動(dòng)態(tài)，研究人員利用單細(xì)胞測(cè)序分析了急性CCL4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型的HSCs。結(jié)果表明PaHSCs和CaHSCs兩個(gè)細(xì)胞亞群均表達(dá)細(xì)胞增殖標(biāo)志物ki67，而只有CaHSCs中纖維化相關(guān)的基因表達(dá)顯著升高。利用RNAscope原位雜交結(jié)合免疫熒光證實(shí)了CaHSCs是在肝小葉中心性損傷導(dǎo)致的纖維化過程中產(chǎn)生病原膠質(zhì)的主要細(xì)胞（見下圖，左圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的NGFR的RNA信號(hào)，右圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的Adamtsl2的RNA信號(hào)）。

年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是致盲的主要原因之一，然而，由于該疾病的遺傳復(fù)雜性，使得確定與AMD相關(guān)的細(xì)胞類型一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。2019年來自麻省理工學(xué)院，哈佛大學(xué)與劍橋大學(xué)的研究人員發(fā)表在《Nature Communication》上的一篇研究論文對(duì)人視網(wǎng)膜進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序分析，報(bào)告了人類視網(wǎng)膜的第一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜[3]。通過對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究人員確定了所有主要的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型，以及它們相應(yīng)的基因表達(dá)特征。研究人員通過scRNA-seq首先鑒定了3種不同的大膠質(zhì)細(xì)胞亞群，表明人類視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)比以前認(rèn)為的要多樣化。3種大膠質(zhì)細(xì)胞亞群分別特異性表達(dá)FOS，F(xiàn)TL, COL4A3。研究人員進(jìn)一步使用RNAscope原位雜交技術(shù)驗(yàn)證并確定了新鑒定的3種大膠質(zhì)細(xì)胞亞群的空間分布（見下圖，A圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的FOS的RNA信號(hào)，黃色為RNAscope檢測(cè)到的FTL的RNA信號(hào)；B圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的COL4A3的RNA信號(hào)，黃色為RNAscope檢測(cè)到的FTL的RNA信號(hào)；C圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的COL4A3的RNA信號(hào)，黃色為RNAscope檢測(cè)到的FOS的RNA信號(hào)）。

研究人員獲得的人視網(wǎng)膜單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜將AMD遺傳風(fēng)險(xiǎn)與細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)Müller膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)AMD相關(guān)基因，包括CFI, TIMP3, VEGFA與COL4A3。研究人員進(jìn)一步使用RNAscope技術(shù)結(jié)合免疫熒光原位驗(yàn)證了在Müller膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的AMD相關(guān)基因（見下圖，A圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的CFI的RNA信號(hào)，B圖紅色為RNAscope檢測(cè)到的TIMP3的RNA信號(hào)；黃色為RNAscope檢測(cè)到的Müller膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物APOE的RNA信號(hào)）。該部分結(jié)果為黃斑變性的分子機(jī)制研究提供了原位空間細(xì)胞分布信息。

迷走神經(jīng)感覺神經(jīng)元是控制器官功能所必需的，但目前對(duì)所涉及的神經(jīng)元類型的復(fù)雜性仍缺乏了解。2019年來自瑞典卡羅林斯卡研究所的研究人員通過scRNA-seq對(duì)頸靜脈和結(jié)節(jié)性迷走神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元類型進(jìn)行了全面的鑒定和分類，鑒定出6種頸靜脈神經(jīng)元和18種節(jié)狀神經(jīng)元[4]。小鼠迷走神經(jīng)神經(jīng)節(jié)復(fù)合體包括神經(jīng)嵴衍生的頸靜脈神經(jīng)節(jié)和基板來源的節(jié)狀神經(jīng)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子Phox2b可作為節(jié)狀神經(jīng)元的標(biāo)志物，另一種轉(zhuǎn)錄因子Prdm12可作為頸靜脈神經(jīng)元的標(biāo)志物。在此研究中，單細(xì)胞測(cè)序鑒定的24個(gè)迷走神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞群中有18個(gè)表達(dá)Phox2b，其余6個(gè)表達(dá)Prdm12。研究人員使用RNAscope技術(shù)進(jìn)一步地量化分析了分別表達(dá)Phox2b與Prdm12的神經(jīng)元的相對(duì)比例（見下圖，紅色為RNAscope檢測(cè)到的Phox2b的RNA信號(hào)，綠色為RNAscope檢測(cè)到的Prdm12的RNA信號(hào)），結(jié)果表明在469個(gè)神經(jīng)元中，386個(gè)表達(dá)Phox2b，83個(gè)表達(dá)Prdm12。與單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果一致，表明迷走神經(jīng)神經(jīng)節(jié)復(fù)合體由約85%的節(jié)狀神經(jīng)元與約15%的頸靜脈神經(jīng)元組成。

scRNA-seq鑒定的6種頸靜脈神經(jīng)元分別命名為JG1-JG6。6種頸靜脈神經(jīng)元分別有相應(yīng)的特異性表達(dá)基因，JG1為Wfdc2，JG2為Mrgprd，JG3為Osmr，JG4為Kit，JG5為Nefh，JG6為Foxp2。為了證實(shí)這6種頸靜脈神經(jīng)元在體內(nèi)的分布，研究人員用RNAscope多重?zé)晒庠浑s交進(jìn)行了驗(yàn)證，針對(duì)不同的神經(jīng)元亞群，分別設(shè)計(jì)了兩種探針，一種是每個(gè)神經(jīng)元亞群對(duì)應(yīng)的特異性表達(dá)基因，一種是頸靜脈神經(jīng)元標(biāo)志基因Prdm12，兩種探針聯(lián)合使用，原位鑒定6種不同的頸靜脈神經(jīng)元（見下圖，RNAscope檢測(cè)到的Wfdc2，Osmr，Kit，Nefh的RNA信號(hào)為綠色，RNAscope檢測(cè)到的Mrgprd，F(xiàn)oxp2的RNA信號(hào)為紅色，白色為RNAscope檢測(cè)到的Prdm12的RNA信號(hào)）。

scRNA-seq鑒定的18種節(jié)狀神經(jīng)元分別命名為NG1-NG18，所有節(jié)狀神經(jīng)元類型都有獨(dú)特的基因表達(dá)模式。研究人員用RNAscope原位雜交的方法檢測(cè)18種節(jié)狀神經(jīng)元的特征基因以及所有節(jié)狀神經(jīng)元的共同標(biāo)志基因Phox2b的表達(dá)，從空間定位上鑒定了18種不同的節(jié)狀神經(jīng)元類型（見下圖，白色為RNAscope檢測(cè)到的Phox2b的RNA信號(hào)，綠色和紅色分別為RNAscope檢測(cè)到的18種節(jié)狀神經(jīng)元的特征基因的RNA信號(hào)）。從而對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了細(xì)胞和原位空間分布的驗(yàn)證。

References

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