Real-Time qPCR（RT-qPCR）優(yōu)點(diǎn)眾多，目前已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，越來越多的研究文章中涉及到RT-PCR實(shí)驗(yàn)，也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十幾年來，RT-qPCR的論文大量發(fā)表，仍面臨著專業(yè)規(guī)范的問題。

主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面>>

01  70%-80%提供數(shù)據(jù)仍不采用PCR實(shí)驗(yàn)指南（MIQE）數(shù)據(jù)規(guī)范及實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)化語言和報(bào)告指南（RDML）語言規(guī)范，表達(dá)不規(guī)范、說服力不足、結(jié)果表述不清、數(shù)據(jù)無法重復(fù)等問題導(dǎo)致被撤稿。

02  追求試劑“低價(jià)”或“品牌崇拜”，缺乏科學(xué)的試劑質(zhì)量評(píng)價(jià) 方法，方法體系的不嚴(yán)謹(jǐn)將造成錯(cuò)誤的結(jié)論。

2017年Stephen Bustin等調(diào)查顯示——說一套，做一套，RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重復(fù)性的典范。（Talking the talk, but not walking the walk：RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch）作者指出許多分子生物學(xué)研究缺乏重現(xiàn)性的根本原因是分子測(cè)量方法報(bào)告不充分。RT-qPCR是RNA定量最直接的測(cè)量技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于研究、診斷、法醫(yī)和生物技術(shù)應(yīng)用，盡管定量PCR實(shí)驗(yàn)指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR數(shù)據(jù)報(bào)告的規(guī)范性和透明度，但調(diào)查顯示錯(cuò)誤的試驗(yàn)方法、不適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析和不充分的報(bào)告仍然普遍存在，大多數(shù)已發(fā)表的RT-qPCR數(shù)據(jù)可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)論誤導(dǎo)。

01

結(jié)果再現(xiàn)性問題

2013年，《自然》(Nature)雜志發(fā)表的一篇論文綜述得出結(jié)論，自MIQE指南發(fā)布以來，有關(guān)RT-qPCR方案的必要信息的報(bào)告實(shí)際上有所惡化。雖然指南強(qiáng)烈建議納入必要的技術(shù)信息，但分析的10篇論文中沒有一篇報(bào)道了這一信息。這意味著沒有向讀者提供任何有關(guān)RNA完整性、RNA純度、RT條件或PCR效率的信息，而且所有的出版物都使用了一種不恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析方法，這種方法在15年前已經(jīng)被質(zhì)疑。作者對(duì)《自然》雜志的20篇近期論文進(jìn)行了重復(fù)分析，得出了基本相同的結(jié)論。更諷刺的是，報(bào)道透明度與期刊的影響因子呈負(fù)相關(guān)。

02

研究RNA表達(dá)的方法

RNA圖譜分析依賴于多種方法，有些方法相對(duì)簡(jiǎn)單，有些方法則復(fù)雜得多，有些方法限制于低通量，還有一些方法允許并行處理大量樣本。作者對(duì)目前使用的主要RNA分析方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述，闡述了許多使用基于RNA的方法發(fā)布的數(shù)據(jù)的可靠性和生物/臨床相關(guān)性引發(fā)激烈辯論的問題，并闡明了導(dǎo)致這些結(jié)果不可靠且需要修正的各種原因

01PCR是目前大多數(shù)使用的方法，而使用凝膠電泳進(jìn)行PCR分析仍在繼續(xù)使用。對(duì)PCR相關(guān)衍生的問題的認(rèn)識(shí)由來已久，早在1992年就有第一份報(bào)告描述了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室之間對(duì)復(fù)制和連續(xù)標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估的不一致性。缺乏一個(gè)涉及PCR的動(dòng)態(tài)過程的理論理解，特別是關(guān)于不可復(fù)制或意想不到的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增，在幾十年前也被強(qiáng)調(diào)。這些觀察結(jié)果和由此產(chǎn)生的影響在很大程度上被忽略了。
02

qPCR和RT-qPCR是快速、簡(jiǎn)單定量核酸的方法，并繼續(xù)被廣泛使用，2016年P(guān)ubMed搜索逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR或RT-qPCR或qRT-PCR，有近5400個(gè)引用。但是該方法的再現(xiàn)行?？煽啃院鸵恢滦允盏劫|(zhì)疑，

03

微陣列技術(shù)與RT-qPCR相比可以處理更多的樣本，比但由于執(zhí)行和分析數(shù)據(jù)所需的復(fù)雜性和時(shí)間的增加，這種方法的流行度正在下降，2016年P(guān)ubMed搜索“微陣列”一詞大約有1600個(gè)引用。

04

RNA-seq是所有RNA profiling方法中技術(shù)最復(fù)雜、最昂貴、最耗時(shí)的一種，使得復(fù)制或重復(fù)實(shí)驗(yàn)的可行性較低。

05

另外兩種中等通量的RNA分析方法是NanoString公司的nCounter分析系統(tǒng)和Thermo Fisher公司的OpenArray系統(tǒng)。前者的優(yōu)點(diǎn)是不需要RT步驟，后者減少了所需的樣品處理量。比較兩種技術(shù)和RT- qPCR的mRNA豐度分析發(fā)現(xiàn)，三種方法的結(jié)果具有廣泛的可比性。然而，盡管NanoString和OpenArray的結(jié)果有很好的相關(guān)性，但RT- qPCR數(shù)據(jù)與兩者有顯著差異。作者將其歸因于常規(guī)RT-qPCR需要大量的移液操作，從而增加了樣品制備的可變性。這些結(jié)果也表明，即使以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行了技術(shù)和分析，結(jié)果也可能是不一致的。這也存在一種可能，即RT-qPCR結(jié)果是正確的，而其他兩種方法得到的結(jié)果是錯(cuò)誤的。

03

RT-qPCR存在的問題

RT- qPCR工作流程表面上簡(jiǎn)單的結(jié)果是，一方面，許多未經(jīng)培訓(xùn)和不熟練的操作人員采用了這項(xiàng)技術(shù)。另一方面，不知道從哪里查找并識(shí)別問題所在，確定報(bào)告的結(jié)果是否可能是真實(shí)的。下面概述了妨礙對(duì)結(jié)果進(jìn)行一致解釋的方法問題，并舉例說明了為什么報(bào)告的結(jié)果常常如此不可靠。

01RNA的質(zhì)量

相關(guān)的質(zhì)量控制措施是任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)前的必要準(zhǔn)備工作，包括確保可靠的qPCR檢測(cè)。RNA在提取和保存過程中有各種物理和化學(xué)因素的降解核酸，因此純度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的總RNA可以劃分為優(yōu)質(zhì)RNA，大于8的RNA可以劃分為完美RNA。這并不是一個(gè)理想的分類，因?yàn)榻到馀c抑制類似，它不是一個(gè)恒定或穩(wěn)定的過程，而是以不同的方式影響轉(zhuǎn)錄。這種不一致的一個(gè)嚴(yán)重后果是，對(duì)純度或降解程度不同的樣品進(jìn)行比較，可能會(huì)顯示出差異，實(shí)際上并沒有差異，或者掩蓋了任何實(shí)際差異。這種不一致性直接影響基因表達(dá)結(jié)果，從而會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

02逆轉(zhuǎn)錄步驟

在首次PCR實(shí)驗(yàn)報(bào)道后不久，結(jié)合RT和PCR步驟檢測(cè)RNA靶點(diǎn)的潛力就被發(fā)現(xiàn)了，并在隨后不久被建議將其用作定量分析。隨后發(fā)現(xiàn)，定量RNA并不像定量DNA那樣簡(jiǎn)單，比如RNA逆轉(zhuǎn)錄后通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增取決于RNA濃度和引物設(shè)計(jì)以及在引物結(jié)合位點(diǎn)避免大量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的RT酶受到這些二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同影響。逆轉(zhuǎn)錄步驟實(shí)際上是可變的，因?yàn)樗怯刹煌膶?shí)驗(yàn)人員進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)人員使用了不同數(shù)量的RNA、各種cDNA反轉(zhuǎn)錄的方法和不同的逆轉(zhuǎn)錄酶。這導(dǎo)致了不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的RT-qPCR結(jié)果可能不一致，而且很難確定哪些結(jié)果是真實(shí)的，哪些結(jié)果是錯(cuò)誤的，尤其是在沒有足夠的分析設(shè)計(jì)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)方案信息的情況下。

03PCR步驟

聚合酶鏈反應(yīng)的穩(wěn)定性并不像看上去那么好，這有幾個(gè)原因：

a.許多已發(fā)表的PCR分析要么設(shè)計(jì)不充分，不可能只擴(kuò)增預(yù)期的目標(biāo)，要么發(fā)表的信息不正確，導(dǎo)致發(fā)表錯(cuò)誤的引物或探針序列；

b.最佳的PCR性能在很大程度上取決于適當(dāng)?shù)哪０逯苽浞椒ǎ?/span>

c.認(rèn)為qPCR檢測(cè)分辨率足夠高的假設(shè)是錯(cuò)誤的。

d.不同制造商的“定量PCR預(yù)混液”是不同的，不同預(yù)混液可能會(huì)影響最后的“差異倍數(shù)”值；

e.對(duì)于一些目的基因，選擇一步法RT-qPCR和兩步法RT-qPCR也會(huì)造成結(jié)果的不一致；

f.許多商業(yè)化熱啟動(dòng)Taq在熱啟動(dòng)前似乎沒有經(jīng)制造商的封閉性測(cè)試，容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，形成引物二聚體；

g.目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率不在線性范圍內(nèi)，而且二者的擴(kuò)增效率也不一致，這極大影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

04

規(guī)范操作建議

01引物和探針的驗(yàn)證

由于任何PCR檢測(cè)的特異性和效率都嚴(yán)重依賴于引物和探針，如果使用，這些都需要仔細(xì)檢查。實(shí)際應(yīng)用中有頻繁的錯(cuò)誤，包括簡(jiǎn)單的排版錯(cuò)誤，對(duì)寡核苷酸序列取向混亂，缺乏特異性的引物，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的PCR擴(kuò)增子。

02測(cè)定核酸的質(zhì)量和完整性

核酸的質(zhì)量和完整性對(duì)于定量結(jié)果的影響是很大的，報(bào)告中為提供此項(xiàng)內(nèi)容，意味著永遠(yuǎn)不清楚作者是否真的檢查了抑制劑的存在，并確定了RNA樣本的完整性，或者只是不報(bào)告他們的結(jié)果。

03RT步驟做3個(gè)重復(fù)

RT步驟應(yīng)該以3個(gè)重復(fù)的方式進(jìn)行，而對(duì)于每個(gè)RT反應(yīng)只進(jìn)行一個(gè)qPCR就足夠了。

04PCR的擴(kuò)增效率應(yīng)該一致

擴(kuò)增效率的不一致，在使用2^-△△cq進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，得到的fold changes值是不準(zhǔn)確的，不是真實(shí)變化值，這可能會(huì)極大地提高基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。

05選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參

使用多個(gè)、穩(wěn)定且經(jīng)過驗(yàn)證的內(nèi)參基因?qū)T-qPCR數(shù)據(jù)歸一化至關(guān)重要，因?yàn)樗斯逃屑夹g(shù)或?qū)嶒?yàn)誘導(dǎo)的差異。

06提供原始數(shù)據(jù)

Cq數(shù)據(jù)應(yīng)該作為補(bǔ)充信息提交，可以以電子表格的形式提交，也可以直接以RDML格式導(dǎo)出。

為了幫助科研用戶更好地甄別定量試劑的特異性和穩(wěn)定性，提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性可嚴(yán)謹(jǐn)性，我們推出了NTC挑戰(zhàn)市場(chǎng)活動(dòng)（僅擴(kuò)增無模板陰性對(duì)照），得到了熱烈反響，在活動(dòng)推出一個(gè)月以來，我們收到了來自不同單位的大量的對(duì)比數(shù)據(jù)，充分證明了試劑間存在的差異會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果的巨大差異，下面附上三個(gè)案例：

案例一

北大某課題組，所用試劑為QST-100和國內(nèi)B公司、Y公司，使用儀器為 ABI 7500.

由擴(kuò)增曲線和CT值可知，QST-100的CT值最高，特異性和穩(wěn)定性最好。

案例二

農(nóng)科院某課題組，所用試劑為QST-100、國內(nèi)Y公司、V公司和國內(nèi)T公司，所用儀器為伯樂C1000.

由擴(kuò)增曲線和CT值可知，QST-100的CT值最高，特異性和穩(wěn)定性最好。

案例三

中山大學(xué)某課題組，所用試劑為QET-100和國外T公司，使用儀器為ABI QuantStudio DX

    

由擴(kuò)增曲線和CT值可知，QET-100的CT值最高，特異性和穩(wěn)定性最好。

從客戶反饋的報(bào)告來看，市面上大多數(shù)試劑未能滿足MIQE無模板對(duì)照不出現(xiàn)擴(kuò)增的條件，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度降低，強(qiáng)烈建議科研用戶選擇符合MIQE的試劑。  QST-100在客戶端也受到了廣泛好評(píng)  

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