SNAP-tag^? 標記技術問題解答               

 細胞顯像和分析常見問題解答

Q. 使用 SNAP-tag^? 標記和 GFP 融合蛋白標記有何不同？

A. GFP 和 SNAP-tag 都是在活細胞內可視化蛋白的有效技術。GFP 是來源于 Aequorea victoria 的熒光蛋白，而SNAP-tag 來源于人 DNA 修復蛋白 hAGT。與 GFP 不同，欲熒光標記與 SNAP-tag 相融合的蛋白，只需在培養(yǎng)基中直接加入各種熒光探針即可。更換不同熒光或者其它功能基團（生物素、磁珠或阻斷劑）時，也無需重新克隆和表達，只要將細胞、細胞裂解物或重組蛋白與需要更換的底物孵育即可。

Q. SNAP- 和 CLIP-tag^? 有何不同？

A. SNAP-tag 和 CLIP-tag 均來源于人 DNA 修復蛋白 hAGT。SNAP-tag 識別 O⁶-標記的芐基鳥嘌呤底物（benzylguanine）而 CLIP-tag 識別 O²-標記的芐基胞嘧啶底物（benzylcytosine）。兩種tag均能將標記物轉移到自身形成特異性的共價結合標記。hAGT 經基因工程改造后不再與 DNA 作用，而與芐基鳥嘌呤和芐基胞嘧啶的衍生物結合。兩種 Tag 之間無交叉反應，因此可以在活細胞內用不同熒光基團同時標記含 SNAP- 和 CLIP- 的融合蛋白。

Q. 蛋白質能融合表達在 tag 的 N 端或 C 端嗎？

A. 能。SNAP- 和 CLIP-tag 都能融合表達在目的蛋白的 N 端或 C 端。但是，選用 ACP 或 MCPtag 標記細胞外表面蛋白時，tag 的克隆方向必須是在細胞膜外的部分，這樣才能與相應的底物進行反應。

Q. 底物對細胞有毒性嗎？

A. 在底物濃度高達 20 μM 時，細胞與底物孵育 2 小時，未見對細胞的增殖和生長有毒性作用。大多數底物在 20 μM 濃度下與細胞孵育 24 小時未見明顯毒性。

Q. 標記蛋白在哺乳動物細胞內的穩(wěn)定性？

A. 標記蛋白在細胞內的穩(wěn)定性取決于目的蛋白的穩(wěn)定性。標記 SNAP-tag 的融合蛋白在哺乳動物細胞內 2 天后仍然能被檢測到。

Q. SNAP-tag 的底物在固定過程中是否穩(wěn)定？

A. 穩(wěn)定。SNAP-tag 的底物熒光來源于有機熒光基團，因此標記的 SNAP-tag 融合蛋白在固定過程中表現非常穩(wěn)定，不會損失信號強度，這點與某些 GFP 發(fā)生光譜變異不同。SNAP-tag 融合蛋白標記后，細胞用常用方法固定如：多聚甲醛、乙醇、甲醇以及甲醇/丙酮等，都不會降低信號強度。

Q. 體內標記 SNAP-tag 的推薦反應條件？

A.SNAP-tag 標記反應可在多種緩沖液中進行。選擇何種緩沖液取決于被融合蛋白的要求。下面是推薦的緩沖液選擇指南：pH 5.0-10.0，單價鹽（如 NaCl）50 mM-250 mM，以及至少 1 mM 的 DTT。如果需要可加入 0.5%v/v 的非離子型變性劑，但是應絕對避免使用 SDS 和其它離子變性劑，因為它們會抑制 SNAP-tag 的活性。金屬離子螯合劑（如 EDTA 和 EGTA）同樣會抑制 SNAP-tag 的活性，因此也不能使用。