單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的生命科學(xué)前沿技術(shù)，它在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞的基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，為生命科學(xué)的研究提供了獨(dú)特的視角。近年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)、腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，成為了生命科學(xué)極具潛力的熱點(diǎn)研究工具。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性，不同檢測(cè)信息在組織中的特異分布，與檢測(cè)結(jié)果的生物學(xué)意義密切相關(guān)。故在單細(xì)胞測(cè)序后重要靶點(diǎn)的原位回溯具有重要的生物學(xué)分析意義。RNAscope原位雜交技術(shù)能直觀可視化基因表達(dá)的空間位置，無懼新發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)無免疫組化抗體，分泌因子或者靶點(diǎn)為非編碼RNA等情況，因此RNAscope對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果回溯到組織原位上進(jìn)行驗(yàn)證提供了重要的技術(shù)手段。本文為大家解讀2020年發(fā)表的使用RNAscope技術(shù)在單細(xì)胞測(cè)序后驗(yàn)證中的應(yīng)用系列文章。

2020年在communication biology上發(fā)表的一篇題為Single-cell Transcriptomes of The Human Hkin Reveal Age-related Loss of Fibroblast Priming的研究中，利用單細(xì)胞測(cè)序系統(tǒng)分析了人皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，鑒定了四個(gè)主要的成纖維細(xì)胞亞群，這些亞群可以在空間上定位并顯示不同的分泌、間充質(zhì)和促炎功能，為人類真皮成纖維細(xì)胞的功能特化提供了證據(jù)，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特性的部分喪失是人類真皮中與年齡相關(guān)的重要變化。

在這項(xiàng)研究中，研究人員從兩名年輕（25歲和27歲）和三名年長(zhǎng)（53歲、69歲和70歲）的捐贈(zèng)者身上獲取了全皮膚樣本，而且為了盡量減少皮膚的光老化效應(yīng)，這些樣本是從男性捐贈(zèng)者的防曬區(qū)域的腹股溝髂區(qū)獲得的。然后對(duì)獲得的皮膚樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果以及數(shù)據(jù)分析鑒定了4個(gè)成纖維細(xì)胞亞群，第一個(gè)亞群是位于網(wǎng)狀真皮中的分泌性網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞，第二個(gè)亞群是位于乳頭狀真皮中的分泌性乳頭狀成纖維細(xì)胞，第三個(gè)亞群被預(yù)測(cè)具有廣泛的定位，顯示出更大的間充質(zhì)潛能的間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，第四個(gè)亞群是促炎癥細(xì)胞群（見下圖）。

為了進(jìn)一步表征和驗(yàn)證單細(xì)胞測(cè)序鑒定的四個(gè)成纖維細(xì)胞亞群，研究人員使用Bio-Techne旗下ACD公司的RNAscope技術(shù)，在福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）皮膚切片中原位檢測(cè)了每個(gè)亞群最具代表性的標(biāo)志基因的表達(dá)。研究人員使用的是RNAscope多通道熒光檢測(cè)的方法，分別檢測(cè)了分泌性網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因CTHRC1（下圖a中綠色信號(hào)點(diǎn)）和分泌性乳頭狀成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因APCDD1的表達(dá)（下圖a中紅色信號(hào)點(diǎn)），并檢測(cè)了泛成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因PDGFRA的表達(dá)作為對(duì)照（下圖a中白色信號(hào)點(diǎn)），RNAscope的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了每個(gè)分泌亞群在乳頭狀真皮層和網(wǎng)狀真皮層中的位置，并且通過RNAscope結(jié)果的定量分析可以統(tǒng)計(jì)分別表達(dá)CTHRC1與APCDD1的陽性細(xì)胞比例，從而得到在乳頭狀真皮層和網(wǎng)狀真皮層中兩個(gè)分泌亞群細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。

對(duì)于另外兩個(gè)成纖維細(xì)胞亞群，研究人員同樣使用RNAscope多通道熒光檢測(cè)的方法，分別檢測(cè)了促炎成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因CCL19與APOE的表達(dá)（下圖b中綠色信號(hào)點(diǎn)為RNAscope檢測(cè)到的CCL19的RNA信號(hào)，紅色信號(hào)點(diǎn)為APOE的RNA信號(hào)），與間充質(zhì)亞群的標(biāo)志基因ASPN的表達(dá)（下圖c中綠色信號(hào)點(diǎn)）。RNAscope的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)促炎成纖維細(xì)胞顯示出更廣泛的分布，在脈管中的分布證實(shí)其與血管系統(tǒng)的優(yōu)先關(guān)聯(lián)。間充質(zhì)亞群主要定位于網(wǎng)狀真皮，尤其是毛囊附近。因此，RNAscope原位檢測(cè)結(jié)果為研究人員通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)獲得的發(fā)現(xiàn)提供了重要的證據(jù)，并為檢測(cè)特定成纖維細(xì)胞亞群建立了標(biāo)記。

RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長(zhǎng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)原理，可以高效敏感地檢測(cè)到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：

應(yīng)用廣泛 

使用RNAscope技術(shù)，靶點(diǎn)RNA為大于等于300個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測(cè)。

特異性強(qiáng)

RNAscope獨(dú)特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要2~4周時(shí)間即可完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測(cè)每個(gè)RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。

單分子可視化和單細(xì)胞定量

使用RNAscope技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對(duì)雙Z探針即可檢測(cè)到目標(biāo)RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn)RNA設(shè)計(jì)的探針為20對(duì)雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測(cè)到靶點(diǎn)RNA。

檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致性

RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測(cè)試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)

由于RNAscope技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見光檢測(cè)中可以在同一張切片上同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測(cè)過程中，可以在同一張切片上檢測(cè)三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn)RNA。

References

1. Lloren? Solé-Boldo, Günter Raddatz, Sabrina Schütz, et al. Single-cell transcriptomes of the human skin reveal age-related loss of fibroblast priming. Commun Biol. 2020; 23;3(1):188.