美國Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術(shù)作為新一代的RNA原位雜交技術(shù)，通過其專利的雙Z探針設(shè)計原理以及信號級聯(lián)放大系統(tǒng)，可以兼容由于空氣中RNA酶對于RNA的部分降解導(dǎo)致一定程度的組織RNA缺損，從而達(dá)到對組織和細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行高效的原位檢測。

在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本，新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進(jìn)行原位雜交的過程中，經(jīng)常會遇到各種各樣的技術(shù)問題。前三期我們就樣本制備，樣本預(yù)處理的一些注意細(xì)節(jié)，以及問題樣本預(yù)處理調(diào)整方案進(jìn)行了探討，本期繼續(xù)就其他一些客戶常見問題給大家提供一些相關(guān)小貼士。

在解決了樣本制備和預(yù)處理問題后，客戶還會遇到的一些RNAscope檢測常見問題有：

1  掉片問題

掉片多見于石蠟樣本和固定冰凍樣本。說是多見，并不意味著這是一個普遍現(xiàn)象，通常按照ACD產(chǎn)品說明書里的樣本制備方法進(jìn)行的樣本制備和其他標(biāo)準(zhǔn)流程操作，掉片現(xiàn)象并不常見。當(dāng)發(fā)現(xiàn)實驗中出現(xiàn)掉片現(xiàn)象時，可以通過以下幾點進(jìn)行調(diào)整：

01

確保使用高粘附載玻片

與免疫組化不同，ACD的包括RNAscope, Basescope，miRNAscope等的操作流程相對較長，除前期預(yù)處理的三個主要步驟，探針雜交2小時以外，后續(xù)還要根據(jù)檢測試劑盒的不同，有若干步Amp的孵育，直到最后顯色（可見光或者熒光）。所以公司推薦使用高粘附的進(jìn)口載玻片進(jìn)行組織切片的粘附和后續(xù)檢測。具體可選用的載玻片請參見說明書或直接與我公司的技術(shù)人員交流(chinaACDFAS@bio-techne.com)。

02

按照公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程制備組織樣本

具體的樣本制備方法在前幾期的軟文以及公司產(chǎn)品說明書里都有描述，這里不再贅述。

03

在進(jìn)行貼片時盡量避免氣泡，適當(dāng)延長烤片時間

貼片時，當(dāng)組織切片與載玻片間沒有完全牢固貼合上，則會降低由于電荷間吸附力下降導(dǎo)致的空隙，在后續(xù)檢測時，這些不牢固區(qū)域會導(dǎo)致掉片；石蠟切片建議在60℃烤箱烤1小時。在脫片的情況下，可以適當(dāng)延長到1個半小時。而固定冰凍樣本切片也可以通過增加烤片環(huán)節(jié)增加粘附（時間可以控制在60℃半小時）。

04

對于石蠟切片和固定后冰凍切片，如果遵守上述操作后仍然有掉片問題，可以參考增加以下步驟進(jìn)行操作。

石蠟切片可以在第一步烤片后或者target retrieval之后增加烤片環(huán)節(jié)，降低脫片問題（見上圖）。

固定后冰凍切片可以在上圖的I（-20℃低溫干燥2小時），II（進(jìn)行后固定），III（增加烤片60℃ 30分鐘環(huán)節(jié)）和IV（去除煮沸步驟但是同時增加蛋白酶處理）環(huán)節(jié)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。最終達(dá)到以下右圖效果。

2  靶探針沒有結(jié)果

在遇到這類問題時，第一時間需要確認(rèn)樣本的陽性對照探針（通常包括PPIB或者UBC）和陰性對照探針(DapB)結(jié)果如何。在眾多此類問題中，有一多半的客戶在確認(rèn)了陽對和陰對探針結(jié)果后，都可以很好的回答靶探針沒信號的問題。即由于樣本本身制備過程中未按照標(biāo)準(zhǔn)流程，固定不充分，導(dǎo)致RNA大幅度降解，故無法檢測到靶探針信號。

針對樣本質(zhì)量沒有問題的客戶，則可以與我們的技術(shù)人員聯(lián)系（chinaACDFAS@bio-techne.com），尋求進(jìn)一步的幫助和指導(dǎo)。

3  特殊樣本怎么辦

在常規(guī)的樣本外，經(jīng)常會遇到客戶使用的是包括類器官，骨骼樣本以及血液等較為特殊的樣本類型，對于這些種類的樣本，有專門的樣本處理和制備方法，可以幫助完成前期包括固定，脫鈣，包埋等一系列問題，最終放置到載玻片上進(jìn)行常規(guī)RNAscope, Basescope等檢測。相關(guān)制備細(xì)節(jié)可參見本公眾號之前發(fā)表的軟文，或與我們的技術(shù)部門同事聯(lián)系詢問細(xì)節(jié)。

最后，在開始實驗前注意以下環(huán)節(jié)，將有助于避免實驗中的常見錯誤，保證整個實驗的順利進(jìn)行。

下一期，我們將RNAscope熒光檢測的一些常見問題進(jìn)行探討，與大家一起了解并加深熒光檢測的操作細(xì)節(jié)和關(guān)鍵點。

RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢如下：

應(yīng)用廣泛 

使用RNAscope技術(shù)，靶點RNA為大于等于300個堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產(chǎn)生完整的信號放大分子結(jié)合位點，并會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設(shè)計合成需要2~4周時間即可完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號的可視化。

單分子可視化和單細(xì)胞定量

使用RNAscope技術(shù)雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標(biāo)RNA，而通常針對靶點RNA設(shè)計的探針為20對雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點RNA。

檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性

RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實驗室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平臺上運行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

多通道多靶點同時檢測

由于RNAscope技術(shù)可以同時進(jìn)行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。