負(fù)責(zé)我們認(rèn)知、意識(shí)的神經(jīng)活動(dòng)主要發(fā)生于我們大腦內(nèi)部，負(fù)責(zé)體表的一系列感覺(jué)有外周神經(jīng)通路，而對(duì)于我們體腔內(nèi)的內(nèi)臟器官的感覺(jué)傳入和神經(jīng)支配，則主要由迷走神經(jīng)完成。迷走神經(jīng)負(fù)責(zé)的組織器官多樣，功能也各不相同，但迷走神經(jīng)核團(tuán)是如何對(duì)各個(gè)內(nèi)臟的傳入信息進(jìn)行區(qū)分和編碼，目前了解的不甚清晰。不同器官傳入的神經(jīng)元涉及種類繁多，對(duì)不同刺激產(chǎn)生應(yīng)答，了解不同類型神經(jīng)元的空間分布及分類特點(diǎn)，對(duì)于理解信息如何編碼匯聚非常重要。2022年3月，美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的常瑞實(shí)驗(yàn)室與張樂(lè)實(shí)驗(yàn)室合作在Nature上發(fā)表了一篇研究，通過(guò)使用RNAscope HiPlex結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序、活體鈣成像等技術(shù)，對(duì)迷走神經(jīng)元進(jìn)行了空間及細(xì)胞活動(dòng)特征的研究^[1]。

作者先在小鼠不同器官內(nèi)分別注射帶有熒光標(biāo)記和不同barcode的逆行AAV病毒，以此標(biāo)記不同器官來(lái)源的迷走神經(jīng)。然后分離出標(biāo)記好的迷走神經(jīng)元做單細(xì)胞測(cè)序，篩選總結(jié)出大量靶標(biāo)，及不同靶標(biāo)在每類神經(jīng)元中的相對(duì)表達(dá)量。隨后作者使用RNAscope HiPlex技術(shù)對(duì)篩選出的不同器官來(lái)源的迷走神經(jīng)元中感興趣靶標(biāo)進(jìn)行了原位驗(yàn)證，并將此方法稱之為“Projection-seq” （圖1）。在多個(gè)組織器官來(lái)源的迷走神經(jīng)元中原位驗(yàn)證結(jié)果與單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果匹配良好，且各靶標(biāo)相對(duì)表達(dá)量與單細(xì)胞測(cè)序接近。

圖1. Projection-seq驗(yàn)證肺臟投射來(lái)源不同亞群迷走神經(jīng)元的靶標(biāo)分布。

隨后，作者在迷走神經(jīng)元中泛表達(dá)鈣指示劑GCamP6s，并在Gpr65陽(yáng)性神經(jīng)元中表達(dá)紅色熒光蛋白指示劑，用于對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行定位。通過(guò)對(duì)小鼠肺、食管、胃腸道等不同內(nèi)臟器官或不同節(jié)段分別進(jìn)行機(jī)械刺激，同時(shí)記錄迷走神經(jīng)元的鈣反應(yīng)情況，之后，再結(jié)合RNAscope HiPlex技術(shù)，對(duì)迷走神經(jīng)元進(jìn)行多靶標(biāo)染色，通過(guò)紅色熒光蛋白定位，將RNA原位信息與鈣活動(dòng)信息整合到一起。作者將此方法命名為“vCatFISH”。通過(guò)vCatFISH，得以讓我們看到對(duì)于相同器官的同一刺激，會(huì)有表達(dá)不同基因的神經(jīng)元產(chǎn)生反應(yīng)，說(shuō)明對(duì)于同樣的刺激，在迷走神經(jīng)元中也存在多個(gè)維度的編碼。神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)對(duì)不同維度信息進(jìn)行整合，最終幫助我們實(shí)現(xiàn)對(duì)刺激強(qiáng)度、時(shí)間、位置等具體細(xì)節(jié)的區(qū)分，從而使機(jī)體對(duì)不同情況進(jìn)行應(yīng)對(duì)。而本篇文章的工作幫助我們未來(lái)對(duì)神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行解碼提供了一種新的選擇和啟發(fā)。

圖2. vCatFISH技術(shù)揭示了對(duì)于機(jī)體不同刺激反應(yīng)的神經(jīng)元的基因特征。

RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來(lái)的生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長(zhǎng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測(cè)原理，可以高效敏感地檢測(cè)到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：

應(yīng)用廣泛 

使用RNAscope技術(shù)，靶點(diǎn)RNA為大于等于300個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測(cè)。

特異性強(qiáng)

RNAscope獨(dú)特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過(guò)程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要2~4周時(shí)間即可完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測(cè)每個(gè)RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。

單分子可視化和單細(xì)胞定量

使用RNAscope技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對(duì)雙Z探針即可檢測(cè)到目標(biāo)RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn)RNA設(shè)計(jì)的探針為20對(duì)雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測(cè)到靶點(diǎn)RNA。

檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致性

RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測(cè)試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。

多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)

由于RNAscope技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見(jiàn)光檢測(cè)中可以在同一張切片上同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測(cè)過(guò)程中，可以在同一張切片上檢測(cè)三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn)RNA。

在RNAscope技術(shù)的基礎(chǔ)上，ACD公司旗下的Basescope技術(shù)可以檢測(cè)RNA水平的外顯子跳躍，點(diǎn)突變，環(huán)狀RNA等；miRNAscope可以原位對(duì)小RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進(jìn)行追蹤定位；而近年來(lái)推出的RNAscope HiPlex技術(shù)則可以在一張石蠟切片上同時(shí)檢測(cè)最多12個(gè)RNA靶標(biāo)的分布定位，成為神經(jīng)科學(xué)，腫瘤微環(huán)境研究以及單細(xì)胞測(cè)序后驗(yàn)證等領(lǐng)域的常用檢測(cè)方法。