酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化         

當(dāng)建立內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時有幾個關(guān)鍵因素需要考慮。比如，如何在反應(yīng)體系中加入適量的 DNA、內(nèi)切酶和緩沖液，就可以獲得最佳酶切效果。根據(jù)定義，在 50 μl 反應(yīng)體系中，1 單位的限制性內(nèi)切酶可以在 60 分鐘內(nèi)完全切割 1 μg 的底物 DNA。上述酶、DNA 與總反應(yīng)體積的比值可以作為建立反應(yīng)體系的參考數(shù)據(jù)。但是，目前大多數(shù)科研人員會遵循下表中所列的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，使用 5-10 倍過量酶切 DNA，這樣有利于克服由于 DNA來源不同、質(zhì)量和純度不同而造成的不利因素。省時反應(yīng)體系用于帶有 Time-Saver 標(biāo)記的限制性內(nèi)切酶，省時內(nèi)切酶可以在 5-15 分鐘切割 DNA。此外，RE-Mix 限制性內(nèi)切酶預(yù)混液也可以使用。NEB 整理了以下有關(guān)內(nèi)切酶反應(yīng)的經(jīng)驗和技巧，以幫助您實現(xiàn)最佳酶切效果。

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：
限制性內(nèi)切酶                      10 units*
DNA                                   1 μg                            
10X NEBuffer                       5 μl (1X)
總反應(yīng)體系           50 μl        
溫育溫度         因酶而異              
溫育時間           60 分鐘
*足夠切割所有類型的 DNA。

省時酶切反應(yīng)體系：
限制性內(nèi)切酶          1 μl
DNA                                         1 μg
10X NEBuffer                          5 μl (1X)
總反應(yīng)體系              50 μl
溫育溫度            因酶而異
溫育時間         5-10 分鐘*
 *具有省時酶切特性的內(nèi)切酶也可以過夜反應(yīng)而沒有星號活性。

內(nèi)切酶

?  從冰箱取出后請一直置于冰上。

?  酶最后加入到反應(yīng)體系中。

?  加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻，可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁，然后在離心機中快速離心。切忌振蕩混 勻。

?  一般情況下，我們推薦使用 5-10 單位酶量/μg DNA，基因組 DNA 用 10-20 單位酶量消化 1 小時。

?  NEB 推出一系列的高保真（HF^TM）內(nèi)切酶，為建立酶切反應(yīng)體系提供了更多便利，有關(guān)高保真酶的更多信息。

DNA

?  避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染。推薦在純化過程中多清洗幾次。

?  甲基化的 DNA 會抑制某些酶的切割效率。

    關(guān)于甲基化更多信息請登陸 www. neb- china.com 及
    www.neb.com。

緩沖液

?  使用終濃度為 1X 的緩沖液。

?  BSA 已被添加到 NEB 緩沖液 1.1、1.2、1.3 和 CutSmart 緩沖液中，無需額外添加 BSA。

?  在不需要 BSA 即可達到最佳活性的酶切反應(yīng)中如果加入 BSA 也不會影響酶切效果。

反應(yīng)體系

?  建議在 50 μl 反應(yīng)體系中消化 1 μg 底物 DNA。

?  加 入內(nèi)切酶的量應(yīng)不超過總體積的 10%，以避免甘油過量引起的星號活性。

?  內(nèi)切酶貯存液中的添加物（如：甘油和鹽）和底物溶液中尚存的殘余物（如：鹽、EDTA 或乙醇）會導(dǎo)致小體 積反應(yīng)出現(xiàn)問題。下述為小體積反應(yīng)技術(shù)指南。

酶切反應(yīng)體系的選擇

* 當(dāng)內(nèi)切酶用量小時，用推薦稀釋液稀釋后使用。

**使用 10 μl 反應(yīng)體系時，溫育時間不要超過 1 小時，以防蒸發(fā)。

 溫育時間

?  標(biāo)準(zhǔn)體系溫育 1 小時，省時酶切體系溫育 5-15 分鐘。

?  使用省時內(nèi)切酶。

?  許多內(nèi)切酶都可以用更少單位的酶消化16小時。詳情請登陸 www.neb-china.com 及 www.neb.com。

終止反應(yīng)

若消化后的 DNA 不需要進行后續(xù)實驗操作：

?  用終止液終止反應(yīng) [50% 甘油、50 mM EDTA（pH 8.0）和 0.05% 溴酚藍]（如 NEB #B7021）。按每 50 μl反應(yīng)體系中加入 10 μl 的比例進行。

若消化后的 DNA 需要進行后續(xù)實驗操作：

?  用 熱失活法（參見 2013﹒2014 商品目錄 278-283 頁或登陸 www.nebchina.com 及 www.neb.com，以確定該酶能否熱失活）。

?  若該酶不能熱失活，利用商業(yè)化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內(nèi)切酶。

貯存

? 大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在 -20℃。只有少數(shù)內(nèi)切酶若貯存時間超過30 天建議保存在 -70℃。
  詳細(xì)的貯存信息請參閱 www.neb.com 及 www.neb-china.com。

? 10X NEBuffer 也應(yīng)保存在 -20℃。

穩(wěn)定性

?  NEB 每 4 個月都會對所有的內(nèi)切酶進行活性檢測。使用期限標(biāo)注在每管產(chǎn)品的標(biāo)簽上。

?  在任何情況下，都應(yīng)盡可能的避免將酶置于高于 -20℃ 的溫度下。

對照反應(yīng)

如果在切割底物 DNA 時遇到了問題，建議加入以下對照實驗：

?  酶切對照 DNA（含有多個已知內(nèi)切酶切割位點的 DNA，如 Lambda DNA 或腺病毒-2 DNA），以檢測內(nèi)切酶的活性。

?  如果對照 DNA 能夠被切割而實驗中的底物 DNA 不能，可以將這兩種 DNA 混合在一起再進行酶切，以檢測實驗用的底物 DNA 中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實存在某種抑制因子（通常為鹽、EDTA 或酚），則混合之后對照 DNA 也不能被切割。

星號活性

?  當(dāng)內(nèi)切酶在非最適條件下使用時可能會產(chǎn)生星號活性（詳細(xì)信息請參考 2013﹒2014 商品目錄 285 頁內(nèi)
   容）。

?  可以通過以下方法降低星號活性：使用高保真（HF）內(nèi)切酶

雙酶切反應(yīng)         

使用兩種限制性內(nèi)切酶同時切割一種底物 DNA（雙酶切反應(yīng)）是一種常見的省時方案。超過 200 種的限制性內(nèi)切酶在CutSmart^TM 反應(yīng)緩沖液中有 100% 的活性，這使得雙酶切反應(yīng)更加簡便。如果您使用的限制性內(nèi)切酶提供的不是CutSmart^TM 反應(yīng)緩沖液，請參考限制性內(nèi)切酶的活性表（參考 2013﹒2014 商品目錄 278-283 頁），它列出了每一種限制性內(nèi)切酶在四種標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液中的活性。

雙酶切反應(yīng)體系的建立

?  CutSmart 限制性內(nèi)切酶的雙酶切可以在CutSmart 反應(yīng)緩沖液中進行。否則，選擇兩種酶都有活性的反應(yīng)緩沖液進行雙酶切反應(yīng)。如果擔(dān)心有星號活性，建議使用高保真（HF）限制性內(nèi)切酶。

?  按推薦條件建立反應(yīng)體系。反應(yīng)體系中甘油的終濃度應(yīng)＜ 5%，以避免星號活性（見 2013﹒2014 商品目錄 285 頁）。例如，50 μl 反應(yīng)體系中總酶量 ≤ 5 μl。

?  如果需要兩種不同溫育溫度，先選擇合適的反應(yīng)緩沖液，加入第一種酶在適合的溫度下反應(yīng)，熱失活第一種酶后再加入第二種酶按推薦溫度溫育。

?  非最佳反應(yīng)緩沖液中反應(yīng)時，適當(dāng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時間，以期克服非最佳反應(yīng)條件帶來的不利因素。

使用特殊緩沖液時雙酶切體系的建立（特殊緩沖液代號為“U”）

?  NEB 目前有三種限制性內(nèi)切酶提供特殊緩沖液：EcoRI、SspI 和 DpnII。在大部分情況下，DpnII 需要進行分步酶切。請注意 EcoRI 有 HF 形式的高保真酶，是提供 CutSmart 緩沖液的。

分步酶切體系的建立

?  如果沒有一個共同的緩沖液使得兩種限制性內(nèi)切酶的活性均大于 50%，就需要進行分步酶切。

?  分步酶切應(yīng)從推薦緩沖液鹽濃度低的酶開始，溫育至酶切完畢。

?  調(diào)整緩沖液中鹽濃度（用小體積濃縮鹽溶液）直至滿足第二種酶的要求。

?  加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。

?  也可在第二步酶切反應(yīng)前過柱純化 DNA。

實驗問題指南