IF 實驗操作步驟
IF 實驗操作步驟
*重要提示：在開始實驗前請查閱所用抗體的說明書中第一頁應用（APPLICATIONS）部分，確認這支抗體已經(jīng)驗證過可用于IF-IC、IF-F或IF-P實驗。以下分別提供實驗步驟。
一. Cultured Cells ( Immunocytochemistry, IF-IC ) Protocol
細胞系培養(yǎng)物來源（IF-IC）
重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-P。
A.所需溶液和試劑
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 20 X 磷酸鹽緩沖液 (PBS) (#9808) : 配制 1L 的 1xPBS，50mL 20xPBS 與 950mL 蒸餾水混勻，調(diào)整PH至8.0。
注：1xPBS配方。3.2mM 磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) ，0.5mM 磷酸二氫鉀 (KH2PO4)，1.3mM 氯化鉀(KCl)，135mM 氯化鈉 (NaCl)，PH7.4。
2. 16%甲醛溶液，無甲醇： Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。開封以后放在4°C避光保存。使用時用PBS稀釋。
3. 封閉緩沖液（1xPBS / 5% normal serum / 0.3% Triton? X-100）：配制 10ml，0.5mL 正常血清（來源與二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驢血清）和 0.5mL 20xPBS 兌到 9mL 蒸餾水中，混勻。邊攪拌邊加入30μL Triton X-100(100%)。
4. 抗體稀釋緩沖液（1xPBS / 1% BSA / 0.3% Triton? X-100）： 配制 10mL 時，取 30μL Triton X-100 加入到 10mL 1 X PBS 中，混勻后加入 0.1g BSA(#9998) ，混勻至全部溶解。
5. 熒光素標記的二抗(每個產(chǎn)品的網(wǎng)頁中有推薦的二抗)
6.封片劑：Prolong? Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong? Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
注意：第一次使用不論是一抗還是熒光素標記的二抗時，都需要做滴定分析以判斷何種稀釋比例能在你的樣品上得到最強的特異信號同時背景保持最低。
B.樣品制備
重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-IC。
注意：細胞應直接在多孔板，腔室玻片或是蓋玻片上直接培養(yǎng)，處理，固定和染色。
1. 用PBS稍加潤洗。
2. 吸去PBS，將細胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（用1xPBS配制）中。
注意：甲醛有毒，需要在通風櫥中操作。
3. 室溫下固定細胞15分鐘。
4. 吸去固定劑，用PBS潤洗三次，每次五分鐘。
5. 繼續(xù)C部分的免疫染色。
C.免疫染色
注意：以下所有的孵育過程，除特殊說明外，需要在室溫下的避光濕盒中進行，以免切片變干和熒光淬滅。
1. 將樣品在封閉液中封閉60分鐘。
2. 封閉結(jié)束前，按說明書的指示用抗體稀釋緩沖液稀釋一抗。
注意：在做雙染時，將兩種抗體按各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
3. 吸去封閉液，加入稀釋的一抗。
4. 在4°C孵育過夜。
5. 吸棄一抗，用PBS潤洗3次，每次5分鐘。
可選：為降低背景，在第2次PBS潤洗和第3次BS潤洗之間可增加高鹽PBS潤洗2分鐘的步驟。但也要注意，這一步可能會降低一些抗體的特異信號。
注意：如果所用一抗直接標記有Alexa Fluor?熒光素，則直接跳到C8步。
6. 把熒光素標記的二抗稀釋在抗體稀釋液中的，將樣品與稀釋抗體在室溫下避光孵育1-2小時。
注意：在做雙染時，將兩種二抗體各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
7. 按第5步用PBS/高鹽PBS潤洗切片。
8. 涂上Prolong? Gold 抗淬滅試劑后蓋上玻片。處理多孔板時，抗淬滅試劑蓋住細胞細胞即可。
9. 在蓋玻片的周圍涂上指甲油密封。
10. 立即在顯微鏡下用相應波長激發(fā)光觀察樣品可以得到最佳的效果。如果要長期保存，將玻片放在4°C避光保存。
二. Frozen/Cryostat Tissue Sections ( IF-F) Protocol
冰凍組織切片（IF-F）
重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-P。
A.所需溶液和試劑
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 20 X 磷酸鹽緩沖液 (PBS) (#9808) : 配制 1L 的 1xPBS，50mL 20xPBS 與 950mL 蒸餾水混勻，調(diào)整PH至8.0。
注：1xPBS配方。3.2mM 磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) ，0.5mM 磷酸二氫鉀 (KH2PO4)，1.3mM 氯化鉀(KCl)，135mM 氯化鈉 (NaCl)，PH7.4。
2. 16%甲醛溶液，無甲醇： Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。開封以后放在4°C避光保存。使用時用PBS稀釋。
3. 封閉緩沖液（1xPBS / 5% normal serum / 0.3% Triton? X-100）：配制 10ml，0.5mL 正常血清（來源與二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驢血清）和 0.5mL 20xPBS 兌到 9mL 蒸餾水中，混勻。邊攪拌邊加入30μL Triton X-100(100%)。
4. 抗體稀釋緩沖液（1xPBS / 1% BSA / 0.3% Triton? X-100）： 配制 10mL 時，取 30μL Triton X-100 加入到 10mL 1 X PBS 中，混勻后加入 0.1g BSA(#9998) ，混勻至全部溶解。
5. 熒光素標記的二抗(每個產(chǎn)品的網(wǎng)頁中有推薦的二抗)
6.封片劑：Prolong? Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong? Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
注意：第一次使用不論是一抗還是熒光素標記的二抗時，都需要做滴定分析以判斷何種稀釋比例能在你的樣品上得到最強的特異信號同時背景保持最低。
B.樣品制備
重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-F。
注意：細胞應直接在多孔板，腔室玻片或是蓋玻片上直接培養(yǎng)，處理，固定和染色。
I. 對固定好的冰凍組織，在工作臺上風干 10 分鐘，然后繼續(xù) C 部分的免疫染色。
II. 對新鮮未固定的組織，立即按照以下步驟固定：
1. 用 PBS 配置的 2-4% 甲醛溶液浸泡組織切片。
注意：甲醛有毒，這一步需要在通風櫥中進行。
2. 室溫下固定細胞15分鐘。
3. 吸去固定劑，用PBS潤洗三次，每次五分鐘。
4. 繼續(xù)C部分的免疫染色。
C.免疫染色
注意：以下所有的孵育過程，除特殊說明外，需要在室溫下的避光濕盒中進行，以免切片變干和熒光淬滅。
1. 將樣品在封閉液中封閉60分鐘。
2. 封閉結(jié)束前，按說明書的指示用抗體稀釋緩沖液稀釋一抗。
注意：在做雙染時，將兩種抗體按各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
3. 吸去封閉液，加入稀釋的一抗。
4. 在4°C孵育過夜。
5. 吸棄一抗，用PBS潤洗3次，每次5分鐘。
可選：為降低背景，在第2次PBS潤洗和第3次BS潤洗之間可增加高鹽PBS潤洗2分鐘的步驟。但也要注意，這一步可能會降低一些抗體的特異信號。
注意：如果所用一抗直接標記有Alexa Fluor?熒光素，則直接跳到C8步。
6. 把熒光素標記的二抗稀釋在抗體稀釋液中的，將樣品與稀釋抗體在室溫下避光孵育1小時。
注意：在做雙染時，將兩種二抗體各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
7. 按第5步用PBS/高鹽PBS潤洗切片。
8. 涂上Prolong? Gold 抗淬滅試劑后蓋上玻片。處理多孔板時，抗淬滅試劑蓋住細胞細胞即可。
9. 在蓋玻片的周圍涂上指甲油密封。
10. 立即在顯微鏡下用相應波長激發(fā)光觀察樣品可以得到最佳的效果。如果要長期保存，將玻片放在4°C避光保存。
三. Paraffin Tissue Sections ( IF-P) Protocol
石蠟組織切片（IF-P）
重要提示：查閱說明書中APPLICATIONS部分，確認所用抗體可用于IF-P。
A.所需溶液和試劑
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
1. 二甲苯
2. 無水乙醇，組織學級（100%和95%）
3. 抗原暴露：
a. 10mM 檸檬酸鈉緩沖液：配置1L時，稱取2.94g二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7?2H2O)溶解在1L蒸餾水中。調(diào)整pH為6.0。
b. 1mM EDTA：配置1L時，稱取0.372g EDTA(C10H14N2O8Na2?2H2O)溶解在1L蒸餾水中。調(diào)整pH為6.0。
4. 10 x TBST(#9997)：配制 1 x TBST 時，取100mL 10 x TBST 加入到 900mL 蒸餾水中，混勻。
5. 孵育緩沖液（1xTBST / 5% normal serum ）：配制10mL，0.5mL 正常血清（來源與二抗相同，例如正常山羊血清 #5425，正常驢血清）和 9.5mL 1xTBST，混勻。
6. 熒光素標記的二抗(每個產(chǎn)品的網(wǎng)頁中有推薦的二抗)
7.封片劑：Prolong? Gold AntiFade Reagent (#9071) , Prolong? Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)
B.脫蠟處理/再水化
注意：在此過程中要避免組織切片干燥。
1. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分鐘。
2. 用無水乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘。
3. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘
4. 在蒸餾水中潤濕2次，每次5分鐘。
C.抗原暴露
注意：請參照產(chǎn)品說明書中具體的抗原暴露操作的建議。
1. 室溫下，將切片泡在10 mM檸檬酸鹽緩沖液中（pH 6.0.）。
2. 用水浴鍋或是微波爐加熱泡在檸檬酸鹽緩沖液中的玻片使之接近沸騰，保持95-99°C約10分鐘。
3. 取出玻片，放在實驗臺上自然冷卻30分鐘。
4. 在蒸餾水中潤洗3次，每次5分鐘。
5. 在PBS中潤洗5分鐘。
6. 繼續(xù)C部分的免疫染色。
D.免疫染色
注意：以下所有的孵育過程，除特殊說明外，需要在室溫下的避光濕盒中進行，以免切片變干和熒光淬滅。
1. 用 1xTBST 洗切片3次，每次5分鐘。
2. 將樣品在封閉液中封閉60分鐘。
3. 封閉結(jié)束前，按說明書的指示用抗體稀釋緩沖液稀釋一抗。
注意：在做雙染時，將兩種抗體按各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
4. 吸去封閉液，加入稀釋的一抗。
5. 在4°C孵育過夜。
6. 吸棄一抗，用PBS潤洗3次，每次5分鐘。
可選：為降低背景，在第2次PBS潤洗和第3次BS潤洗之間可增加高鹽PBS潤洗2分鐘的步驟。但也要注意，這一步可能會降低一些抗體的特異信號。
注意：如果所用一抗直接標記有Alexa Fluor?熒光素，則直接跳到D9步。
7. 把熒光素標記的二抗稀釋在抗體稀釋液中的，將樣品與稀釋抗體在室溫下避光孵育1小時。
注意：在做雙染時，將兩種二抗體各自合適的比例加入到抗體稀釋緩沖液中配成混合液。
8. 按第5步用PBS/高鹽PBS潤洗切片。
9. 涂上Prolong? Gold 抗淬滅試劑后蓋上玻片。處理多孔板時，抗淬滅試劑蓋住細胞細胞即可。
10. 在蓋玻片的周圍涂上指甲油密封。
11. 立即在顯微鏡下用相應波長激發(fā)光觀察樣品可以得到最佳的效果。如果要長期保存，將玻片放在4°C避光保存。
推薦的二抗
Anti-Rabbit
抗兔：
1. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?488 Conjugate) #4412
2. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?555 Conjugate) #4413
3. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?647 Conjugate) #4414
4. Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (DyLight? 488 Conjugate) #4315
Anti-Mouse
抗小鼠：
1. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?488 Conjugate) #4408
2. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?555 Conjugate) #4409
3. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor?647 Conjugate) #4410
4. Anti-Mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (DyLight? 488 Conjugate) #4316
Anti-Rat
抗大鼠：
1. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor? 488 Conjugate) #4416
2. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor? 555 Conjugate) #4417
3. Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor? 647 Conjugate) #4418
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