WB 實(shí)驗(yàn)操作步驟

A. 溶液和試劑

從樣品制備到檢測(cè)，您進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法時(shí)所需要的試劑現(xiàn)均包含在一個(gè)便利的試劑盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

了解我們的溶液與試劑

注：利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級(jí)別的水制備溶液。

1. 20 X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)：(?#9808) 為了制備 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后將其混勻。

2. 10X Tris 鹽緩沖液 (TBS)：(?#12498) 要制備 1 L 1X TBS：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X，然后混勻。

3. 1X SDS 樣品緩沖液：Blue Loading Pack (#77227723) 或Red Loading Pack?(#) ；通過(guò)添加 1/10 體積的 30 X DTT 至 1 體積的 3 X SDS 上樣緩沖液，制備新鮮的 3 X 還原上樣緩沖液。用 dH2O 將其稀釋至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液：(?#4050) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 電泳緩沖液，然后混勻。

5. 10X Tris-Glycine 轉(zhuǎn)移緩沖液：(?#12539) 要制備 1 L 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液：向 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中添加 100 ml 10X 轉(zhuǎn)移緩沖液，然后混勻。

6. 10X Tris Buffered Saline with Tween? 20 (TBST)：(?#9997) 要制備 1 L 1X TBST：向 900 ml dH2O 中添加 100 ml 10X TBST，然后混勻。

7. 脫脂奶粉：(#9999)。

8. 封閉緩沖液：含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST；要制備 150 ml，向 150 ml 1X TBST 中添加 7.5 g 脫脂奶粉并充分混勻。

9. 洗滌緩沖液：(#9997) 1X TBST。

1.     牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。

2.     一抗稀釋緩沖液：如一抗數(shù)據(jù)表上所示，含 5% BSA 或 5% 脫脂奶粉的 1X TBST；要制備 20 ml，向 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脫脂奶粉并充分混勻。

12. 生物素化的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)包：(#7727)。

13. 預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，寬范圍 (11-190 kDa)：(#13953)。

14. 印跡膜和紙：(#12369) 本實(shí)驗(yàn)步驟已針對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行了優(yōu)化。通常推薦 0.2 μm 孔徑。

15. HRP 偶聯(lián)二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠(#7076)。

16. 檢測(cè)試劑：LumiGLO?化學(xué)發(fā)光試劑和過(guò)氧化物 (#7003) 或 SignalFire? ECL Reagent (#6883)。

 B. 蛋白質(zhì)印跡

制備樣品的常規(guī)流程。

樣品制備、SDS-PAGE 和轉(zhuǎn)移

1. 添加含有調(diào)節(jié)分子的新鮮培養(yǎng)基，使其在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

2. 從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基；用 1X PBS 洗滌細(xì)胞；吸出。

3. 加入 1X SDS 樣品緩沖液裂解細(xì)胞（6 孔板每孔加 100 μl 或直徑為 10 cm 盤中加 500 μl）。立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管。置于冰上。

4. 超聲處理 10–15 秒以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA（以降低樣品粘度）。

5. 取 20 μl 樣品，在 95–100°C 下加熱 5 分鐘；放在冰上冷卻。

6. 微量離心機(jī)內(nèi)離心 5 分鐘。

7. 取20 μl 上樣到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。

注：建議將預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（#13953，5 μl/泳道）上樣以驗(yàn)證電轉(zhuǎn)移和將生物素化的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品 (#7727，10 μl/泳道）上樣以確定分子量。

1. 電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 (#12369)。

C. 膜封閉和抗體孵育

封閉和抗體孵育

注：以下所用試劑體積數(shù)適用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；對(duì)于不同尺寸的膜，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整體積。

I. 膜封閉

1. （可選）轉(zhuǎn)移之后，在室溫下用 25 ml TBS 將硝酸纖維素膜洗滌 5 分鐘。

2. 將膜置于 25 ml 封閉緩沖液中，在室溫下孵育 1 小時(shí)。

2. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

II.一抗孵育

根據(jù)所使用的一抗，繼續(xù)下述其中一項(xiàng)的具體步驟。

對(duì)于無(wú)偶聯(lián)的一抗

1. 將膜和一抗（按照產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中建議的適當(dāng)稀釋度和稀釋液）置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

3. 按一抗來(lái)源選取合適的 HRP 偶聯(lián)的二抗（#7074 或 #7076，按 1:2000），同時(shí)加入anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075?，按 1: 1000-1:3000）以檢測(cè)生物素化的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。置于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時(shí)并不時(shí)輕輕攪動(dòng)。

1. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

2. 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

對(duì)于偶聯(lián)有HRP 的一抗

1. 將膜和一抗（按照產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中建議的適當(dāng)稀釋度）置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

3. 與檢測(cè)生物素酰化蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075?，按 1: 1000-1:3000）在室溫下于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時(shí)并不時(shí)輕輕攪動(dòng)。

1. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

2. 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

對(duì)于生物素化的一抗

1. 將膜和一抗（按照產(chǎn)品數(shù)據(jù)表中建議的適當(dāng)稀釋度）置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

將膜與 Streptavidin-HRP （#3999 以適宜的稀釋度）在室溫下于 10 ml 封閉緩沖液中孵育 1 小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

1. 用 5 ml TBST 洗滌三次，每次 15 分鐘。

2. 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

3. 請(qǐng)勿加入用于檢測(cè)生物素化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。沒(méi)有必要。Streptavidin-HRP 也將會(huì)使生物素化標(biāo)準(zhǔn)品可視化。

 D. 蛋白質(zhì)檢測(cè)

蛋白質(zhì)檢測(cè)

1. 將膜與 10 ml LumiGLO?（0.5 ml 20X LumiGLO? #7003、0.5 ml 20X 過(guò)氧化物和 9.0 ml 凈化水）或 10 ml SignalFire? #6883（5 ml 試劑 A，5 ml 試劑 B）在室溫下孵育1 分鐘并不時(shí)輕輕攪動(dòng)。

2. 將膜上多余的顯影液瀝干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射線膠片曝光。從剛開(kāi)始的 10 秒曝光時(shí)間中可以看出適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間。

注：由于檢測(cè)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征，在孵育后信號(hào)立即變得最強(qiáng)，但在隨后的 2 小時(shí)內(nèi)會(huì)減弱。

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Western Blotting Application Solutions Kit #12957

 本文來(lái)自CST博士互助平臺(tái)