IHC 實(shí)驗(yàn)操作步驟
免疫組化方法（石蠟切片）
*重要提示：參考抗體說明書選用合適的抗體稀釋液和抗原修復(fù)處理方法。IHC方法：抗原修復(fù)緩沖液/抗體稀釋液
A. 所需溶液和試劑
1. 二甲苯
2. 無水乙醇（100% 和 95%，變性無水乙醇，組織學(xué)級）
3. 去離子水（dH2O）
4. 蘇木精（可選）
5. 漂洗（緩沖）液：
1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)：配制時，取100 ml 10X TBS加900 ml水稀釋至1升。加入1 ml Tween-20，混勻。
10X Tris緩沖鹽水(10X TBS)：在800 ml蒸餾水中加入24.2 g 三羥甲基氨基甲烷（Trizma base, C4H11NO3）和80 g 氯化鈉（NaCl）。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)到7.6，定容至1 L。
6. *抗體稀釋液
a. SignalStain? 抗體稀釋液 #8112
b. TBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X TBST 中添加250 μl正常山羊血清。
c. PBST / 5%正常山羊血清： 5 ml 1 X PBST 中添加250 μl正常山羊血清。
1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制時，取100 ml 10X PBS加900 ml水稀釋至1 L。加入1 ml Tween-20，混勻。
10X 磷酸鹽緩沖液 (10X PBS): 在800 ml水中加入80 g 氯化鈉（NaCl）, 2 g 氯化鉀（KCl）, 14.4 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和2.4 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。調(diào)整pH到7.4，定容至1 L。
7. *抗原修復(fù)：
a. 檸檬酸鹽：10 mM檸檬酸鹽緩沖液：稱取2.94g二水合檸檬酸鈉（C6H5Na3O7?2H2O）溶解在800 ml水中。調(diào)整pH為6.0，定容至1 L。
b. EDTA: 1mM EDTA: 稱取0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2?2H2O) 溶解在800 ml水中。調(diào)整pH為8.0，定容至1 L。
c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制時，稱取1.21 g Trizma?堿（C4H11NO3）和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2?2H2O) 溶解在950 ml蒸餾水中。調(diào)整pH到9.0，然后用蒸餾水定容至到1 L。
d. 胃蛋白酶：1 mg/ml，溶解在pH為2.0的Tris鹽酸緩沖液中。
8. 3%過氧化氫：配制時，將10 ml 30% H2O2加入到90 ml蒸餾水中。
9. 封閉液：TBST/5%正常山羊血清：5 ml 1X TBST中添加250 μl正常山羊血清。
10. 檢測系統(tǒng)：根據(jù)廠家說明書使用。已有的檢測系統(tǒng)：
SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125
注意: 如果本產(chǎn)品沒有使用本試劑優(yōu)化過，可能需要通過滴定法來確定最佳條件。
11. DAB試劑或合適的底物：按產(chǎn)品說明配制。
B. 脫蠟處理/再水化
注意：操作中任何時候都不要晾干玻片
1. 脫蠟處理/切片的水化：
a. 用二甲苯浸洗切片3次，每次5分鐘。
b. 用無水乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘。
c. 用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分鐘
2. 在蒸餾水中漂洗2次，每次5分鐘。
C. *抗原修復(fù)
注意：參考抗體說明書選用合適的抗原修復(fù)緩沖液，按以下步驟操作。
1. 檸檬酸緩沖液處理：加熱浸泡在10 mM pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中的玻片，使之維持在準(zhǔn)沸騰的溫度（95-99°C）10分鐘。取出放在實(shí)驗(yàn)臺上自然冷卻30分鐘。
2. EDTA處理：加熱浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片，使之維持在準(zhǔn)沸騰的溫度（95-99°C）15分鐘。不需另加冷卻步驟。
3. TE處理：加熱浸泡在pH 9.0的10 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片，使之維持在準(zhǔn)沸騰的溫度（95-99°C）18分鐘。取出放在實(shí)驗(yàn)臺上自然冷卻30分鐘。
4. 胃蛋白酶處理：37°C消化10分鐘。
D. 染色
注意：查詢產(chǎn)品說明書推薦的抗體稀釋比例。
1. 切片用漂洗液洗兩次，每次5分鐘。
2. 浸泡在3% H202中孵育10分鐘
3. 用蒸餾水漂洗兩次，每次5分鐘。
4. 用漂洗液洗5分鐘
5. 在切片上滴加100-400 μl封閉液，室溫封閉1小時。
6. 去掉封閉液，每個切片上加100-400 μl稀釋的一抗。4°C孵育過夜。
7. 去掉抗體稀釋液。用漂洗液洗3次，每次5分鐘。
8. 根據(jù)廠家說明書，用合適的檢測系統(tǒng)檢測。
9. 用漂洗液洗3次，每次5分鐘。
10. 加入100–400 μl DAB或合適的底物，近距離檢測染色進(jìn)展。
11. 一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中。
12. 如有需要，將切片泡在蘇木精溶液中復(fù)染，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。
13. 切片用蒸餾水洗兩次，每次5分鐘。
14. 切片脫水：
a. 在95%乙醇中孵育兩次，每次10秒。
b. 在100%乙醇中孵育兩次，每次10秒。
c. 在二甲苯中孵育兩次，每次10秒。
15. 加上蓋玻片。
免疫組化方法（冰凍切片）
A. 所需溶液和試劑
1. 二甲苯
2. 無水乙醇（100% 和 95%，變性無水乙醇，組織學(xué)級）
3. 蘇木精（可選）
4. 固定劑：請參考產(chǎn)品說明書選取合適的固定劑。
a. 10%中性福爾馬林
b. 丙酮
c. 甲醇
d. 3%甲醛溶液：配制時，將18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。
5. 10X Tris緩沖鹽水（10X TBS）：在800 ml蒸餾水中加入24.2 g 三羥甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化鈉（NaCl）。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)到7.6。
6. 漂洗（緩沖）液：1 X Tris緩沖鹽水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。
7. 甲醇/過氧化氫：配制時，將10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。
8. 封閉液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。配制時，將500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。
9. 檢測系統(tǒng)：根據(jù)廠家說明書使用。已有的檢測系統(tǒng)*。
10. DAB試劑或合適的底物：按產(chǎn)品說明配制。
B. 切片
1. 對于保存在-80°C的樣品：切片前先從冰箱中取出放在-20°C平衡15分鐘左右。這可以避免切片時樣品斷裂。
2. 將樣品切成大約6-8 μm厚，鋪在帶正電性的玻片上。
3. 固定前，可以把切片攤開放在實(shí)驗(yàn)臺上風(fēng)干幾分鐘。（這有助于切片貼緊玻片）
C. 固定
注意：參考產(chǎn)品說明書（抗體）選擇合適的固定劑
1. 玻片上的切片風(fēng)干后，選用如下合適的固定劑進(jìn)行固定。
a. 10%中性福爾馬林：室溫10分鐘。立即進(jìn)行染色操作。
b. 冰丙酮：-20°C 10分鐘。風(fēng)干。立即進(jìn)行染色操作。
c. 甲醇：-20°C 10分鐘。立即進(jìn)行染色操作。
d. 3%甲醛溶液：室溫15分鐘。立即進(jìn)行染色操作。
e. 3% 甲醛/甲醇：先在室溫下3%甲醛中固定15分鐘，然后在-20°C的甲醇中固定5分鐘（中間不漂洗）。立即進(jìn)行染色操作。
D. 染色
1. 切片用漂洗液洗兩次，每次5分鐘。
2. 室溫下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分鐘
3. 用漂洗液洗兩次，每次5分鐘。
4. 在切片上滴加封閉液，室溫封閉1小時。
5. 按抗體說明書的推薦比例將抗體稀釋在封閉液中。
6. 去掉切片上的封閉液，每個切片上加100-400 μl稀釋的一抗。4°C孵育過夜。
7. 去掉抗體。用漂洗液洗3次，每次5分鐘。
8. 根據(jù)廠家說明書，用合適的檢測系統(tǒng)*檢測。
9. 用漂洗液洗3次，每次5分鐘。
10. 加入100–400 μl DAB或合適的底物，近距離檢測染色進(jìn)展。
11. 一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中。
12. 如有需要，將切片泡在蘇木精溶液中復(fù)染，按照產(chǎn)品說明進(jìn)行。
13. 切片用蒸餾水洗兩次，每次5分鐘。
14. 切片脫水：
a. 在95%乙醇中孵育兩次，每次10秒。
b. 在100%乙醇中孵育兩次，每次10秒。
c. 在二甲苯中孵育兩次，每次10秒。
15. 加上蓋玻片。
*已有的檢測系統(tǒng)：
SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114
SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125
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