克隆概述                

傳統(tǒng)的克隆實驗包括以下幾種操作：將DNA 片段插入到質(zhì)粒中，以修飾或引入抗性基因、啟動子和信號序列或開放閱讀框等，用于基因表達或下游蛋白表達研究。在開始克隆實驗之前定出克隆策略是很重要的。需要考慮的問題有：酶切后是否有與目標載體匹配的末端，插入序列在載體上可能的方向，以及插入序列是否在讀碼框內(nèi)，是否會影響翻譯。以下指南有助于克隆的設(shè)計和相關(guān)問題的解決。

準備插入片段和質(zhì)粒

來源于質(zhì)粒的插入片段
? 選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割質(zhì)粒，獲得能直接克隆于載體的 DNA 片段。選擇產(chǎn)生不同末端的兩種限制性內(nèi)切酶來進行單向克隆。關(guān)于優(yōu)化限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的指導(dǎo)和問題解決建議，見 2013﹒2014 商品目錄 275-277 頁或 NEB網(wǎng)站的技術(shù)參考部分。
 

來源于 PCR 的插入片段
? 引物設(shè)計時引入能單向克隆到載體的限制位點
? 大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的識別位點上游需要 6 個保護堿基
? 如需高保真擴增可以選擇具有校讀功能的聚合酶，如：Q5^? 超保真DNA 聚合酶（NEB #M0491)
? PCR 優(yōu)化指南和問題解決見 2013﹒2014 商品目錄 325-326 頁或 NEB 網(wǎng)站上技術(shù)參考部分
? PCR 產(chǎn)物可通過凝膠電泳回收或離心柱純化
? 選擇用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化

來源于退火寡核苷酸的插入片段
? 退火的寡核苷酸用來引入 DNA 片段（如啟動子和聚合接頭等）
? 兩條帶有互補的 5′ 或 3′ 突出末端寡核苷酸退火后能被連接到用適合的限制性內(nèi)切酶切割的載體中
? 未磷酸化的寡核苷酸用 T4 PNK (NEB #M0201)

常規(guī)退火反應(yīng)

寡核苷酸                                 5 μl (10 μM 儲液)
10X 連接緩沖液                      5 μl
總體積                                     至 50 μl
溫度                                         85℃ 10 分鐘，緩慢降溫（30-60 分鐘）

載體
? 選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化載體，最好使用能產(chǎn)生不匹配末端的內(nèi)切酶，以防載體自連。
 

去磷酸化
? 去磷酸化反應(yīng)是用來防止自身連接。NEB 提供兩種 DNA 去磷酸化的產(chǎn)品。
   – 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）（NEB #M0290）是一種活力較強的去磷酸化酶，在許多不同條件下及各種NEBuffer 中均有活性。然而，CIP 不能被熱失活，因此需要在連接前純化 DNA。建議 CIP 的使用量不要超過推薦用量，以達到更好的純化效果。
   – 熱敏磷酸酶（AnP)（NEB #M0289）不僅具備 CIP 的所有功能而且還能被熱失活。AnP 需要鋅離子發(fā)揮活性

AnP 去磷酸化
AnP                                              1 μl（5 單位）
DNA                                             1-5 μg
10X 緩沖液                                  2 μl（終濃度 1 mM）
總體積                                           至 20 μl
溫育                                             37℃ 15 分鐘（5′ 突出末端/平末端）或 60 分鐘（3′ 突出末端）
熱失活                                          65℃ 5 分鐘

平齊化/末端修復(fù)
? 有時插入的片段和載體需要進行末端平齊化/末端修復(fù)
? 用具有校讀活性的聚合酶進行 PCR，其產(chǎn)物的絕大部分是平末端
? T4 DNA 聚合酶（NEB #M0203）或 Klenow（NEB #M0210）能補平 5′ 突出末端（如 EcoRI-HF），切割 3′ 突出末端（如 PstI-HF）
? 快速末端平齊試劑盒（NEB #E1201）能在 30 分鐘內(nèi)完成 DNA 末端的平齊化和磷酸化

 磷酸化
? 連接兩個 DNA 片段時，至少其中一個片段的末端應(yīng)含有 5′ 磷酸（插入片段或載體）
? 引物通常以非磷酸化形式提供，因此 PCR 產(chǎn)物的 5′ 末端為非磷酸化，限制性內(nèi)切酶消化的 DNA 其 5′ 末端都有磷酸化

? DNA 片段可以通過與 T4 PNK NEB #M0201）溫育進行磷酸化

T4 PNK 磷酸化

T4 PNK                                           1 μl（10 單位）
DNA                                                 1–2 μg
10X T4 PNK 緩沖液                       5 μl
10 mM ATP                                     5 μl（終濃度 1 mM）
無核酸酶污染的水                          至 50 μl
溫育                                                  37℃ 30 分鐘

純化載體和插入片段
? 連接反應(yīng)前，用凝膠電泳切膠回收或離心柱回收方法純化載體或插入片段
? β-瓊脂糖酶 I（NEB #M0392）可以用于純化低熔點瓊脂糖中的 DNA，DNA 的純化還可用離心柱及樹脂法
? 用長波 UV（360 nm）觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，以減少 UV 暴露造成的 DNA 損傷

連接載體和插入片段

? NEB 目前提供預(yù)混液形式的連接酶，請在 2013﹒2014 商品目錄第 100 頁的連接酶選擇表格中選擇
? 載體和插入片段的摩爾比為 1:3
? 室溫解凍并混勻連接緩沖液
? 平末端連接需要延長連接時間或使用高濃度的連接酶/連接酶預(yù)混液
? 連接后置于冰上并進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)
? 用快速連接緩沖液或連接酶預(yù)混液時勿熱失活，以免抑制轉(zhuǎn)化反應(yīng)

轉(zhuǎn)化
? 關(guān)于感受態(tài)細胞的信息和屬性，請參考2013﹒2014 商品目錄第 202-213 頁
? 提高感受態(tài)細胞效率的方法，請參考 2013﹒2014 商品目錄第 323 頁
? 通過電擊的方式轉(zhuǎn)化，建議您選擇電轉(zhuǎn)連接酶^TM

用 NEB 連接酶連接

使用 Gibson 組裝試劑盒克隆

Gibson 組裝試劑盒中，包含 NEB 5-alpha E. coli 感受態(tài)細胞，經(jīng)過優(yōu)化，該試劑盒在一個試管中經(jīng)等溫反應(yīng)，可以高效的將 1 或 2 個組裝片段插入到任何載體，完成組裝和克隆。更多詳細信息請參考 2013﹒2014
商品目錄第 127 頁或登陸 NEB 網(wǎng)站查詢。

 設(shè)計引物
? 為了高效組裝 PCR 片段到載體中，建議使用 15-25 個核苷酸重疊序列的引物，且其 Tm 值等于或高于 48℃
? 為了更有效的設(shè)計 Gibson 組裝引物，建議您登陸 NEBGibson.com 使用在線引物設(shè)計軟件 NEBuilder 設(shè)計
   引物，也可以參考 Gibson 組裝引物設(shè)計說明 PCR 擴增片段
? 建議使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0491）或相關(guān)產(chǎn)品（NEB #M0493, NEB #M0492）擴增組裝片段
? 以質(zhì)粒為模板進行擴增時，建議每50μl PCR 反應(yīng)體系中使用微量的 DNA（0.1–0.5 ng）進行擴增
? 通過凝膠電泳驗證 PCR 產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量
? 如果產(chǎn)物純度 ＞ 90%，就無需對 PCR 產(chǎn)物進行純化
? 在 Gibson 組裝反應(yīng)體系中，未純化的 PCR 產(chǎn)物可以占到 20%
? 如果必須使用大量的質(zhì)粒作為模板，擴增后用 DpnI（#R0176）消化 PCR 產(chǎn)物以降低背景

載體線性化
? 使用限制性內(nèi)切酶線性化質(zhì)粒時，NEB 建議使用兩種限制性內(nèi)切酶進行雙酶切以降低未切割載體的背景
? NEB 推薦您使用 Q5 超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0491）或者相關(guān)產(chǎn)品（NEB #M0493，NEB #M0494）擴增載體

建議反應(yīng)體系 & 條件
? 純化用于組裝的 DNA，可以溶于 dH₂O（推薦使用 Milli-Q 水或同等純度的水）、TE 或者其它稀釋緩沖液
? 當組裝 1-2 個片段到一個載體中時，NEB 推薦您使用總量為 0.02-0.5 pmols 的 DNA 片段
? 為了優(yōu)化組裝，在加入 Gibson 組裝預(yù)混液之前調(diào)整 DNA 的體積到 10 μl
? 若 DNA 的體積大于 10 μl，相應(yīng)的調(diào)整 Gibson 組裝預(yù)混液的體積
? Gibson 組裝試劑盒經(jīng)優(yōu)化可在 50℃ 15 分鐘完成組裝。反應(yīng)時間無需超過 15 分鐘，某些情況下延長時間（60 分鐘）可提高效率
? 不要過夜反應(yīng)
 

Gibson 組裝克隆方法流程

 轉(zhuǎn)化到 NEB 5-alpha 高效 E. coli 感受態(tài)細胞
? NEB 5-alpha 高效 E. coli 感受態(tài)細胞（包含在試劑盒中）建議用于組裝＜ 20 kb 的片段
? 大腸桿菌對有些 DNA 結(jié)構(gòu)有選擇拮抗，如倒置和串聯(lián)重復(fù)序列，可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率極低或者生長極差的小克隆
? 電轉(zhuǎn)化可以把轉(zhuǎn)化效率提高幾個數(shù)量級，因此 Gibson 組裝預(yù)混液用于電擊轉(zhuǎn)化時，必須把反應(yīng)體系稀釋 3 倍，再取 1 μl 用于轉(zhuǎn)化。

克隆問題解決指南                

下面的指南可用于解決分子克隆實驗中所出現(xiàn)的問題。關(guān)于優(yōu)化轉(zhuǎn)化實驗的其它建議參閱 2013﹒2014 商品目錄 323 頁。

遺傳標記                

基因型反映了機體 DNA 的遺傳狀態(tài)，是一個理論概念?；蛐蜎Q定了株系的外在特性（即表型，見下述）。在E. coli  中，一般只列出缺失基因（1），沒有列出的基因，即被認為沒有突變^*+。原 K-12 菌株中的前噬菌體和質(zhì)粒（F、λ、e14、rac）一般不列出，除非其有缺失。但是，λ存在于菌株時則被列入基因型中，所有情況下 F  因子及其變體也都列出。前噬菌體和質(zhì)粒用圓括弧或方括弧標示出。基因用三個斜體的小寫字母示（如dam），便于記憶且能描述該基因的功能（dam 即表示 DNA adenine methylase，DNA 腺嘌呤甲基化酶）。
如果同一功能受幾個基因調(diào)控，就用大寫斜體字母來區(qū)別這幾個基因（如：recA、recB、recC 和 recD 均能調(diào)控重組功能）?；蛐驼?guī)的表達法應(yīng)省略上標 +/-，但有時為了更清楚地反映遺傳信息而并未將其省掉，比如F′ lac-proA+B+。缺失突變用 Δ 表示，并在其后用圓括弧標出缺失基因的名稱 [如 Δ (lacpro ) ]，標出的兩基因之間的基因并未列出，但也屬缺失基因。特定的突變標出其等位基因號，通常用斜體阿拉伯數(shù)字表示（如 hsdR17），而且也可用一些特殊標記來說明某突變，如 am = amber(UAG)  突變或 ts = 高溫失活。有些常見的等位基因也不一定都遵循這些原則（如：Δ (lac-pro ) X111）。如果在兩種菌株的基因型中列出了帶有相同等位基因號的基因，那么它們應(yīng)含有完全相同的突變。

菌株的表型即為該菌株所表現(xiàn)出來的形態(tài)行為特性，如：Lac^- 表示不能以半乳糖作為唯一碳源生長。表型用大寫羅馬字母表示，并總標有上標 +/- [或者 r(resistant) /s (sensitive) ]。嚴格地說，表型并不屬于基因型范疇，但當基因型的描述并非十分具體明了時，也常將表型列于基因型之后 [如：rpsL104 (Str^r)- 基因名 rps 源自 ribosomal protein, small subunit, S12,具有鏈霉素抗性]。

下面和下一頁描述了一些常見的基因。參考文獻2 收集了所有遺傳定義的基因，也可登陸耶魯大學(xué)的 E.coli Genetic Stock Center（CGSC）網(wǎng)站http://cgsc.biology.yale.edu/ 查看。CGSC 上的其它信息可通過發(fā)送郵件（cgsc@yale.edu）從館長 Mary Berlyn 處獲得。
 

*經(jīng)過四十多年的研究，大多數(shù) E. coli  實驗室菌株已發(fā)生了嚴重的突變，且不同的株系可能存在不同的、至今尚未發(fā)現(xiàn)的突變，這些突變可能會也可能不會對科研實驗產(chǎn)生影響?；谶@個原因，在實驗過程中，最好嘗試一種以上或選用不同來源背景的菌株。
 

?E. coli B 及其衍生型一般是 Lon^- 和 Dcm^- 型，即使它們是野生型時，我們也將 Lon^- 和 Dcm^- 列于方括號中。
 

參考文獻
(1) Demerec et al. (1966) Genetics, 54, 61–76.
(2) Berlyn, M.K.B. (1996). In F. C. Niedhardt et al. (Ed.), Escherichia coli and Salmonella:cellular and 
      molecular biology, (2nd ed.), Vol. 2, (pp. 1715–1902). ASM Press.
(3) Raleigh, E.A. et al. (1991) J. Bacteriol., 173, 2707–2709.

dam  缺失內(nèi)源 GATC 腺嘌呤甲基化功能。Dam菌株有較高的重組頻率，不斷地發(fā)揮 DNA 修復(fù)功能難以轉(zhuǎn)入 Dam 修飾的質(zhì)粒。用于制備對某些限制性內(nèi)切酶（如BclI）切割敏感的 DNA。

dcm  缺失內(nèi)源 CCWGG 胞嘧啶甲基化功能。用于制備對某些限制性內(nèi)切酶（如 AvaII）切割敏感的 DNA

dnaJ  一種伴侶蛋白被失活。這種缺失可以穩(wěn)定 E. coli 菌株中表達的某些突變蛋白。

dut  無 dUTPase 活性。同 ung 一起可催化尿嘧啶摻入到 DNA 上。適用于某些寡核苷酸突變實驗。

endA  非特異性核酸內(nèi)切酶 I 活性缺失。應(yīng)用 endA 菌株可制備出高質(zhì)量的 DNA。

e14  一種可切割的類前噬菌體元件，存在于K-12 中，但在很多衍生菌株中丟失。e14 帶有 mcrA 基因，因此e14^- 菌株也屬于 McrA^- 型。

F   低拷貝數(shù)的自傳遞型質(zhì)粒。F′ 因子帶有部分 E. coli 染色體 DNA，特別是如 F′ lacproA⁺B⁺ 上的 lac 操縱子和 proAB。

fhuA  鐵離子轉(zhuǎn)運受體發(fā)生了突變，并由此獲得對 T1 噬菌體的抗性（氧肟酸鐵鹽轉(zhuǎn)運，ferric hydroxamate uptake）。以前命名為 tonA。

gyrA  在 gyrase 亞基 A DNA 上有點突變，因此，具有新霉素抗性。

hflA  增加了 λ噬菌體感染時的溶源化幾率。

hsdR,  不含有特定序列甲基化的 DNA 可被

hsdS    EcoKI 或 EcoBI 視為異物并被消化降解。這些酶識別不同的序列，由 hsdRMS 的不同等位基因編碼。突變體去除了消化限制功能但保留了保護性甲基化功能（r^-m⁺），而 hsdS 突變體則去除了這兩種功能（r^-m^-）。后者制備的DNA 轉(zhuǎn)入野生型菌株時將被消化掉。

提高轉(zhuǎn)化效率                

轉(zhuǎn)化效率定義為轉(zhuǎn)化 1 μg 質(zhì)粒至給定體積的感受態(tài)細胞中所能產(chǎn)生的菌落形成單元（cfu）的數(shù)量。但是，轉(zhuǎn)
化 1 μg 質(zhì)粒是不常見的。實際上，轉(zhuǎn)化效率常以在最適條件下轉(zhuǎn)化 100 pg-1 ng 高純度超螺旋質(zhì)粒來計算。計
算轉(zhuǎn)化效率（TE）的公式為：TE = 菌落數(shù)/μg/稀 得最佳實驗結(jié)果。

推薦方案

高效轉(zhuǎn)化方法
1. 冰上解凍細胞 10 分鐘
2. 細胞中加入 1 pg-100 ng 的質(zhì)粒 DNA（1-5 μl），混勻，切忌蝸旋
3. 置于冰上 30 分鐘
4. 42℃ 熱激 10-30 秒或根據(jù)推薦條件進行熱激
5. 置于冰上 5 分鐘
6. 加入 950 μl 室溫的 SOC
7. 37℃ 振蕩（250 rpm）培養(yǎng) 60 分鐘
8. 混勻細胞，切忌蝸旋，并用 SOC 做系列 10 倍稀釋
9. 每個稀釋比例取 50-100 μl 稀釋液涂布于預(yù)熱的選擇平板上，37℃（SHufflee? 菌株 30℃）過夜培養(yǎng)或按推薦條件培養(yǎng)
 

5 分鐘轉(zhuǎn)化方法
( 與上述方法相比只有 10% 的轉(zhuǎn)化效率 )
1. 手握解凍細胞
2. 細胞中加入 1 pg-100 ng 的質(zhì)粒 DNA (1-5 μl)，混勻，切忌蝸旋
3. 置于冰上 2 分鐘
4. 42℃ 熱激 30 秒或按推薦條件進行熱激
5. 置于冰上 2 分鐘
6. 加入 950 μl 室溫的 SOC?？焖偃?50-100 μl涂布于選擇平板上，37℃ 過夜培養(yǎng)（Shuffle 菌株30℃）。
    注意：使用非氨芐青霉素時，可能需要在涂板前生長一定時間

轉(zhuǎn)化技巧

解凍
? 細胞最好在冰上解凍
? 管中的最后一點冰融化后，立即加入 DNA
? 可以手握解凍細胞，但是一旦溫度高于0℃ 時，轉(zhuǎn)化效率就會下降

細胞與 DNA 冰育
? 冰育 30 分鐘。預(yù)計每縮短 10 分鐘會降低轉(zhuǎn)化效率 2 倍
 

熱激
? 溫度和時間取決于轉(zhuǎn)化體積和使用的容器，一般為 42℃ 孵育 30 秒

生長
? 37℃ 生長 1 小時對于細胞恢復(fù)和抗生素抗藥性表達具有最佳效果。預(yù)計每縮短 15 分鐘會有 2 倍的轉(zhuǎn)化效率損失
? SOC 比 LB 培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化效率高 2 倍
? 振蕩或旋轉(zhuǎn)晃動試管可使轉(zhuǎn)化效率提高 2 倍
 

平板
? 平板可冷可溫，可干可濕，對轉(zhuǎn)化效率無明顯影響
? 干溫的平板更易于涂布，并實現(xiàn)快速菌落形成

DNA
? 用于轉(zhuǎn)化的 DNA 應(yīng)純化，并重懸于水中或TE 緩沖液中
? 直接從連接混合物中取 10 μl 的 DNA 用于轉(zhuǎn)化，僅有 2 倍效率損失
? 為實現(xiàn)最佳轉(zhuǎn)化，可通過柱離心或酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法純化 DNA
? 最適 DNA 用量比通常認為的要低，純化超螺旋 pUC19 的用量在 100 pg-1 ng 之間時轉(zhuǎn)化效率最高。但是，隨著 DNA 用量增加至100 ng，單次轉(zhuǎn)化反應(yīng)中得到的總克隆數(shù)也會增多

避免 DNA 污染

用 T7 表達菌株進行蛋白表達                

T7 蛋白表達
1. 轉(zhuǎn)化表達質(zhì)粒至 T7 表達菌株，涂布于抗生素選擇平板，37℃ 培養(yǎng)過夜（SHuffle^? 菌株30℃ 生長 24 小時）。
2. 挑一個獨立菌落至 10 ml 含抗生素的液體培養(yǎng)基中。
3. 37℃ 培養(yǎng)直至 OD₆₀₀ 達到 0.4-0.6。
4. 加 40 μl 100 mM IPTG 貯存液（終濃度 = 0 .4 mM），37℃ 誘導(dǎo) 2 小時（SHuffle 菌株 30℃ 生長 4 小時或16℃ 生長過夜）。
5. 通過考馬斯亮藍染色蛋白膠、Western Blot 或活性檢測來觀察表達情況。檢查總細胞提取物（可溶+ 不溶的）和可溶性部分的表達情況。
6. 大規(guī)模表達時，應(yīng)取新生菌落或新鮮 10 ml 培養(yǎng)液接種到 1 升液體培養(yǎng)基（含抗生素）中，37℃ 培養(yǎng)直至 OD₆₀₀ 達到 0.4-0.6。加IPTG 至終濃度為 0.4 mM，37℃ 誘導(dǎo) 2 小時或 15℃ 過夜（SHuffle 菌株 30℃ 生長 4 小時或 16℃ 生長過夜）。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)問題解

無菌落或液體培養(yǎng)基中無細菌生長
? 即使 T7 表達為嚴格調(diào)控型，但是 T7 表達宿主菌中也可能存在低水平的基礎(chǔ)表達。如果表達的蛋白可能有毒性，表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化應(yīng)使用下列系統(tǒng)：
? I^q 菌株中過量表達的 LacI^q 抑制物能夠降低 T7 RNA 聚合酶的基礎(chǔ)表達。
? 在 lysY 菌株中，突變的 T7 溶解酶與 T7RNA 聚合酶相結(jié)合，從而減少目的蛋白的基礎(chǔ)表達。誘導(dǎo)后，新合 成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用，目的蛋白得到表達。
? 30℃ 或室溫培養(yǎng)也可減輕毒性問題。
? 檢查抗生素濃度（用對照質(zhì)粒檢測）。、

電泳無蛋白或無蛋白活性
? 檢查毒性—細胞可能刪除或缺失了表達質(zhì)粒的元件。如果有毒性表達問題，試用I^q和/或 lysY 宿主以減少基礎(chǔ)表達。
? 培養(yǎng)用于誘導(dǎo)蛋白表達的細胞。誘導(dǎo)前，將樣品平行涂布于有抗生素和無抗生素選擇標記的平板。如果有毒性產(chǎn)生，則兩個平板菌落數(shù)會有顯著的不同。在含抗生素的平板上，菌落生長數(shù)量極少（表明質(zhì)粒丟失了）。

誘導(dǎo)蛋白不可溶

T7 表達蛋白經(jīng)常產(chǎn)量非常高，導(dǎo)致目的蛋白不可溶，解決方案如下：
? 低溫誘導(dǎo)（低溫 12-15℃ 過夜）
? 降低 IPTG 濃度至 0.01 mM-0.1 mM
? 縮短誘導(dǎo)時間（可以縮短至 15 分鐘）
? 細胞生長早期開始誘導(dǎo)（OD₆₀₀ = 0.3 或 0.4）

轉(zhuǎn)化反應(yīng)問題解決指南                

下面的指南可用于解決轉(zhuǎn)化過程中所出現(xiàn)的問題。關(guān)于設(shè)計與優(yōu)化克隆實驗的其它建議見 2013﹒2014
商品目錄 318-319 頁。