酶的存活性              

長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)，內(nèi)切酶的活性保持情況因酶而異。

+ + + 酶活性時(shí)間 ＞ 8 小時(shí)

+ +     酶活性時(shí)間 4-8 小時(shí)

+        酶活性時(shí)間 2-4 小時(shí)

–      不建議反應(yīng)時(shí)間 ＞ 1 小時(shí)

大多數(shù)限制性內(nèi)切酶常規(guī)酶切時(shí)間為 1 小時(shí)或更短。某些反應(yīng)要求加入酶量 ＜ 1 單位/μg DNA 同時(shí)相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 ＞ 1 小時(shí)。下表可做為低酶量或反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)的操作指南。 

例如，1 單位 AatII 能在 16 小時(shí)溫育后消化 8 μg DNA（+++）。

根據(jù)內(nèi)切酶單位定義檢測(cè)延時(shí)酶切活性，其中標(biāo)準(zhǔn)的 1 小時(shí)反應(yīng)時(shí)間改為 16 小時(shí)。表中標(biāo)注有“+++”的酶是能延時(shí)酶切的內(nèi)切酶，這些酶 16 小時(shí)酶切 1 μg DNA 僅需 0.13 單位的酶量；表中標(biāo)注有“++/+” 的酶是具有中等活性的延時(shí)內(nèi)切酶，16 小時(shí)完全酶切 1 μg DNA 需要 0.25（++）或 0.50（+）單位的酶量；標(biāo)注有“-”的酶，需要 1 單位才能達(dá)到完全酶切，與 1 小時(shí)反應(yīng)時(shí)間需要的酶量一樣。

超螺旋 DNA 的切割                

限制性內(nèi)切酶對(duì)不同底物 DNA 切割效率不同。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下用質(zhì)粒 pBR322、pUC19 和 pLITMUS 檢測(cè)內(nèi)切酶切割超螺旋質(zhì)粒的能力。盡量先用每種質(zhì)粒中的單一識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)有多個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)取其平均值，用 λDNA 作為陽(yáng)性對(duì)照（所有情況下切割它所需酶量均為 1 個(gè)單位）。