限制性內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性         

NEB 目前提供超過 200 種 CutSmart 內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶在 CutSmart 緩沖液中活性為 100%。這大大提高了內(nèi)切酶的效率、靈活性和簡便性，尤其是進(jìn)行雙酶切時(shí)。

該表總結(jié)了 NEB 所有限制性內(nèi)切酶的活性信息。為了幫助您選擇雙酶切的最佳條件，該表列出了酶的最佳活性 NEBuffer（隨酶提供）和每種內(nèi)切酶在四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的活性。需要注意的是 BSA 現(xiàn)在已經(jīng)添加到緩沖液中，不再單獨(dú)提供。雙酶切反應(yīng)體系請參考 2013﹒2014 商品目錄第 276 頁。此外，活性表中列出了反應(yīng)溫度、熱失活溫度、推薦稀釋液、甲基化敏感性和該酶是否有省時(shí)酶特性（即在建議的反應(yīng)條件下，5-15 分鐘可完全切割底物，過夜酶切也不會(huì)降解 DNA）。

注：表中數(shù)值為近似值，所用底物與內(nèi)切酶定義中的底物相同，更新的內(nèi)容請查閱 www.neb-china.com 及
        www.neb.com。

反應(yīng)溫度：

表中列出了限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度。對于最適反應(yīng)溫度不是 37℃ 的限制性內(nèi)切酶，請閱 2013﹒2014 商品目錄 284 頁查詢其在 37℃ 時(shí)的活性。

熱失活：

熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡便易行的方法。大多數(shù)最適反應(yīng)溫度為 37℃ 的酶，在 65℃ 條件下溫育 20 分鐘即可失活。一些在 65℃ 下不能失活的酶如將溫度升高至 80℃，溫育 20 分鐘也可失活。下表注明了該酶能否進(jìn)行熱失活以及熱失活的相應(yīng)溫度。

稀釋緩沖液：

稀釋限制性內(nèi)切酶時(shí)，建議使用稀釋緩沖液（A、B 或C）。建議用前稀釋且稀釋終濃度不要低于 1,000 units/ml。目錄及說明書中標(biāo)注了每一種內(nèi)切酶相應(yīng)的稀釋緩沖液。

稀釋緩沖液成份：

稀釋液 A：

50 mM KCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀釋液 B：

300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，500 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀釋液 C：

250 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.15% Triton X-100，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

活性注意事項(xiàng)：

1. 延時(shí)酶切、高酶濃度或者甘油濃度超過 5% 會(huì)導(dǎo)致星號活性。

2. 延長酶切時(shí)間會(huì)導(dǎo)致星號活性。

3. 甘油濃度超過 5% 會(huì)導(dǎo)致星號活性。

*在該緩沖液中可能會(huì)出現(xiàn)星號活性。

活性圖

DNA 修飾酶在 CutSmart 反應(yīng)緩沖液中的活性           

在常用的克隆酶中，選出了一系列 DNA 修飾酶，用 CutSmart 緩沖液代替隨酶提供的緩沖液，進(jìn)行酶活檢測。比較酶在 CutSmart 緩沖液（添加必須的輔助因子）和隨酶提供的緩沖液中的活性。反應(yīng)體系是根據(jù)修飾酶的推薦反應(yīng)體系建立的，用 CutSmart 反應(yīng)緩沖液替代隨酶提供的反應(yīng)緩沖液。結(jié)果比較如下表中所示。

+ + + 具完全功能活性           + + 具 50-100% 功能活性                         + 具 0-50% 功能活性

星號活性（特異性降低或改變）                

在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號活性。有人提出，這種“星號”活性可能是內(nèi)切酶的一種普遍特性（1），如果提供給相應(yīng)反應(yīng)條件，所有內(nèi)切酶都會(huì)出現(xiàn)非特異性切割。雖然星號活性產(chǎn)生的傾向性不同，但是當(dāng)使用隨酶提供的NEBuffer 時(shí)，內(nèi)切酶不會(huì)產(chǎn)生星號活性。如果已經(jīng)報(bào)道該酶存在星號活性，那么在產(chǎn)品目錄、說明書和網(wǎng)站上會(huì)做說明。

酶識別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號活性的反應(yīng)條件影響。常見的引起酶識別改變的條件有：單堿基替換、識別序列外側(cè)堿基縮短以及單鏈切刻（2）。有些酶顯示在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下序列特異性降低，并且有同源位點(diǎn)時(shí)，能夠切開非同源（次級）位點(diǎn)（3）。

注：上述反應(yīng)條件的改變對于每種酶的影響不同。

NEB 建議使用 50 μl 反應(yīng)體系進(jìn)行酶切。但在必須使用小體積酶切時(shí)，需要注意以上列舉的各種情況以避免星號活性。
此外，可使用 NEB 的系列產(chǎn)品高保真內(nèi)切酶（HF）可以使操作更簡便。更多高保真內(nèi)切酶信息請查詢 NEB 的網(wǎng)站。

降低星號活性的 HF 內(nèi)切酶                

下表為 HF 內(nèi)切酶和其野生型在檢測到明顯星號活性前的最大酶用量。HF 指數(shù)代表在選擇 HF 內(nèi)切酶時(shí)酶用量增加的倍數(shù)，數(shù)據(jù)清楚顯示了 HF 內(nèi)切酶帶來的靈活性。
 

高保真限制性內(nèi)切酶            

NEB 一直致力于限制性內(nèi)切酶的研究和改進(jìn)，現(xiàn)向您提供最新系列的高保真限制性（HF）內(nèi)切酶。這些酶與其野生型有相同的特性，在 CutSmart 反應(yīng)緩沖液中都有活性，但經(jīng)基因工程改造后降低了星號活性。星號活性或特異性降低是限制性內(nèi)切酶的天然特性。大多數(shù)酶在推薦條件下反應(yīng)是不會(huì)導(dǎo)致星號活性，然而，對于已報(bào)道有星號活性的內(nèi)切酶，為避免非特異性切割，一定要按照推薦的反應(yīng)條件建立反應(yīng)體系。

很多技術(shù)需要在非最佳條件下使用內(nèi)切酶，如：克隆、基因分型、突變檢測、基因定位、探針制備、測序和甲基化檢測等。HF 內(nèi)切酶降低了星號活性，給酶切反應(yīng)提供更多選擇并能在更多情況下獲得最好的切割效果。

除了降低星號活性外，所有的 HF 內(nèi)切酶都能在兼容性最強(qiáng)的 CutSmart 反應(yīng)緩沖液中達(dá)到最佳切割效果，因此簡化雙酶切反應(yīng)。此外 HF 內(nèi)切酶全都是省時(shí)內(nèi)切酶，能在 5-15 分鐘內(nèi)消化底物。HF 內(nèi)切酶與原酶的價(jià)格相同。

關(guān)于高保真內(nèi)切酶更多相關(guān)信息，請查詢 NEB 網(wǎng)站 www.neb-china.com 及 www.neb.com/HF。

高保真限制性內(nèi)切酶常見問題解答

Q.為什么 HF 內(nèi)切酶推薦使用的緩沖液與野生型的內(nèi)切酶不同？

A. 在許多情況下，突變導(dǎo)致高保真內(nèi)切酶的最適緩沖液發(fā)生變化。比如，野生型 SalI 酶的最適緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強(qiáng)度緩沖液，然而 SalI-HF^? 的最適緩沖液為中等離子強(qiáng)度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 緩沖液有什么優(yōu)勢嗎？

A. 是的，超過 200 種限制性內(nèi)切酶（包括高保真限制性內(nèi)切酶）在 CutSmart 緩沖液中有活性。當(dāng)建立雙酶切反應(yīng)時(shí)有很大優(yōu)勢。 

具有省時(shí)酶特性（Time-Saver?）的限制性內(nèi)切酶                

效率高，5-15 分鐘實(shí)現(xiàn)快速酶切；純度高，過夜酶切不降解。 

無論您是在進(jìn)行大量克隆的快速篩選還是進(jìn)行過夜酶切，NEB 高品質(zhì)的酶都會(huì)給您帶來更大的便利。通常，進(jìn)行限制性酶切時(shí)都需要在 50 μl 反應(yīng)總體系中，加入 1 μl 酶反應(yīng) 1 小時(shí)來消化 1 μg 純化的 DNA。但是，若選用 NEB Time-Saver 特性的酶，可以大大加速您的篩選進(jìn)程。這些酶在建議反應(yīng)條件下，加入 1 μl 就可以在5-15 分鐘內(nèi)消化 1 μg DNA。且這些酶在產(chǎn)品規(guī)格、濃度上沒有任何改變，也不需要重新購買更貴的新產(chǎn)品來實(shí)現(xiàn) 5-15 分鐘快速酶切，這與其他供應(yīng)商的產(chǎn)品完全不同。溫育時(shí)間過長你也不必?fù)?dān)心。

為了向您提供更多信息，NEB 通過單位定義底物 DNA 和質(zhì)粒 DNA 測試了所有酶的活性。只建議用作參考，不適用于所有的質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶通常顯示出的位點(diǎn)優(yōu)勢效應(yīng)，是由識別位點(diǎn)側(cè)翼序列決定的。此外，超螺旋DNA 的切割速率變化很大，更多信息請參見網(wǎng)站的技術(shù)支持部分。注意以下有些內(nèi)切酶可以在 5-15 分鐘切割底物，但是不能用于過夜酶切，因此不具有 TimeSaver 特性。

由于所有 NEB 的酶都經(jīng)過核酸酶污染的嚴(yán)格檢測，您可以放心的進(jìn)行長時(shí)間酶切而不必?fù)?dān)心樣品降解。只有NEB，可以提供給您如此高的效率和純度，效率高—5-15 分鐘實(shí)現(xiàn)快速酶切；純度高—過夜酶切樣品不損失。

省時(shí)內(nèi)切酶的效率和純度：

1 μl SalI 5 分鐘內(nèi)消化 1 μg DNA，結(jié)果顯示長時(shí)間酶切或過夜 (O/N) 消化沒有核酸酶污染。
Marker (M) 是 1 kb DNA Ladder (NEB #N3232) 。